• هیچ محصولی در سبد خرید نیست.

دستورالعمل بخش میکروب شناسی

  1–  هدف:
هدف از تهیه این دستورالعمل  شناسایی عوامل اصلی در انجام آزمایش اعم از مواد، محیطهای کشت، کنترل کیفی محیطها، دیسکها … جهت اطمینان از نتایج بدست امده برای گزارش وجوابدهی به بیمار
 2- دامنه کاربرد : دامنه این روش ، بخش میکروب شناسی می باشد.  
3- تعاريف : محیط کشت : محیط آماده  ایست دارای ترکیبات بیوشیمیایی مختلف ، جهت تغذیه و رشد و شناسایی باکتریها دیسک آنتی بیوگرام : معرفی که دارای مقدار مشخصی از آنتی بیوتیک به منظور تعیین حساسیت  باکتری  نسبت آن می باشد. سوش باکتری : باکتری معلوم از نظر گونه و سویه جهت کنترل محیط های کشت و دیسک ها سایر واژه گان، بصورت تخصصی می باشد.  
4- مسئولیت : مسئول اجرای این دستورالعمل مسئولین بخش میکروب شناسی ومسئول کنترل کیفی آزمایشگاه می باشد. مسئولیت  نظارت بر حسن اجرای این ر وش بر عهده نماینده مدیریت، سوپر وایزر و مدیر فنی آزمایشگاه می باشد. 5 – مدارك مرتبط: روش اجرایی کنترل مدارک وسوابق روش اجرایی محصول نامطبق روش اجرایی اقدامات اصلاحی و پیشگیرانه
توجه : همکار گرامی لطفا” توجه فرمایید ; این دستورالعمل با فرمت استاندار15189  ISO و بر اساس روشهای معمول نگارش شده است ، لذا هر آزمایشگاه میبایست با الگو برداری از این متن اقدام به تکمیل کردن و یا اصلاح کردن آن بر اساس روش ، کیت و دستگاه مورد استفاده  در آزمایشگاه خویش ، آن را شخصی سازی کند .    
فهرست شماره پاتوژن های شایع در عفونتهای بعضی از قسمتهای بدن
1 دستورالعمل نگهدری نمونه هایی که امکان کشت سریع آنها وجود ندارد
2 رنگامیزی گرم
3 دستورالعمل انجام افتراقی برای شناسایی باکتری
4 تعیین حساسیت میکروبی (آنتی بیوگرام)
5 حساسیت باکتریها نسبت به آنتی بیوتیک
6 دستورالعمل تشخیص باکتریهای گرم مثبت
7 دستورالعمل نگهداری سویه های باکتری
8 دستورالعمل حفظ ونگهداری محیطهای کشت و دیسکهای آنتی بیوگرام
9 معیارهای رد و قبول نمونه های بالینی
10 جمع آوری نمونه
11 دستورالعمل های کنترل کیفیت  دستورالعمل های کنترل کیفیت محیط های کشت محیط TSI  / محیط MR-VP 12 محیط  SIM /  تست سیمون سیترات /  تست اوره آز
13 محیط  Lysine Iron Agar / محیط بایل اسکولین آگار/ محیط
SFM 14 تست اکسیداز/ تست ONPG / تست حلالیت در صفرا / تست تعیین حساسیت به اپتوچین
15 تست تعیین حساسیت باسیتراسین /  تست   CAMP استریپی /  تست کواگولاز
16 کنترل کیفی محیط مولر هینتون /  محیط سلنیت
F 17 محیط شکلات اگار /  کنترل کیفی محیط های کشت / 
روش انجام آزمون کنترل کیفیت محیط های کشت
18 بررسی آزمایش های عملکردی محیط کشت
19 نحوه تفسیر نتایج کشت خون
20 نحوه انجام وتفسیر کشت مدفوع /  نحوه انجام وتفسیر نتایج کشت ادرار
21 کشت CSF و سایر مایعات استریل بدن 22
دستورالعمل روش انجام آزمایش
Wound S &C 23 ترشحات چشم- گوش- بيني- مجرا- واژن- پوستولهاي بدن
24 بررسی نمونه های دستگاه تناسلی در زنان باردار از نظر استرپتوکوکوس آگالاکتیه / کشت نمونه تناسلی
25 نحوه انجام و تفسیر کشت ترشح مجرا /  آزمایش مستقیم
26 کشت نمونه تنفسی
27 دستورالعمل روش اطلاع رسانی در صورت نیاز به نمونه گیری مجدد
28 دستورالعمل ساخت محلول کنترل کیفی نیم مک فارلند /  دستورالعمل کنترل کیفی لوپ                             فهرست :
29 شرح شماره عفونت استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی سیلین (MRSA )
30 عفونت انتروکوک های مقاوم به وانکومایسین( VRE)
31 جدول کنترل کیفی دیسکهای آنتی بیوگرام
32 دستورالعمل کنترل کیفی دیسک های آنتی بوتیک
33 جدول نگهدارنده های نمونه ادرار
34 جدول تشخیص افتراقی استافیلوکوک
35 جدول انتخاب آنتی بیوتیک جهت انجام آزمایش تعیین حساسیت میکروبی
36 جدول استفاده از آنتی بیوتیک ها
37 جدول قطر هاله
38 صفات بیوشیمیایی در گونه های مهم جنس انتروباکتر
39صفات بیوشیمیایی در گونه های مهم جنس کلبسیلا
40 صفات بیوشیمیایی مهم برای متمایز کردن گونه های جنس شیگلا
41 صفات بیوشیمیایی گونه های مهم در جنس سالمونلا
42 جدول آزمون های تشخیصی در اعضای مهم جنس استرپتوکوک
43 صفات بیوشیمیایی در سه گونه مهم جنس استافیلوکوک
44 Biochemical reaction of subgenera of Salmonellبرخی دیگر از اختصاصات بیوشیمیایی سالمونلاها
45 جدول اختصاصات بیوشیمیایی انواع سوش کلبسیلا(Klebsiella)
46 جدول انتروباکتریاسه
49 جدول اختصاصات بیوشیمیایی اشرشیا کلی(E.Coli)    
 Reactions of Esherichila coli 50 جدول اختصاصات استافیلوکوک ها
51جدول افتراق بین کوکسی های گرم مثبت خوشه ای
52 جدول اختصاصات بیوشیمیایی استرپتوکوک ها
Streptococci 53 تفرق بین پنوموکوک با استرپ ویریدانس
54 حداقل مدت زمانی که برای استریلیزاسیون در مجاورت دماهای مختلف گرمای مرطوب و خشک مورد نیاز می باشد .
55 باسیلوس ها
56 صفات بیوشیمایی در جنس های مهم از خانواده انتروباکتریاسه
57مدت زمان انکوباسیون محیط های کشت
58 موارد بحرانی در آزمایشگاه میکروب شناسی
59 جدول پاتوژن های شایع عضو بدن / کانون عفونت نوع پاتوژن گوش خارجی سودوموناس آئروژینوزاپروتئوس هااشیریشیاکلی گوش میانی استرپتوکک پنومونیه هموفیلوس آنفلوآنزا استرپتوکک گروه A بتاهمولتیک چشم نیسر یا گونوره آهموفیلوس آنفلوآنزاکلامیدیا تراکوماتیسسودوموناس آئروژینوزا واژن نیسر یا گونوره آکلامیدیا تراکوماتیساستافیلوککگارد نرلاواژینالیساسترپتوکک بتاهمولتیک گروه B زخم و آبسه استافیلوکک اورئوساسترپتوکک پیوژنز(گروهA)آنتروکک هاسودوموناس آئروژینوزا حلق استرپتوکک گروه A بتاهمولتیکاستافیلوکک اورئوسکورینه باکتریوم دیفتریه
هموفیلوس آنفلوآنزا خون ستافیلوکک اورئوس (اپیدرمیدیس در بیماران معتاد به مواد مخدر)نیسریا مننژیتیدیسباکتری های بی هوازی مدفوع سالمونلاهااشریشیاکلی (درکودکان زیر دو سال)شیگلایرسینیا آنتروکولیتیکا ادرار اشریشیاکلای  90 % <کلبسیلااستافیلوکک ساپروفیتیکوساستافیلوکک
اپیدرمیدیس
شرح اقدامات:
ابتدا نمونه‌ها به بخش ميكروشناسي منتقل مي‌شوند و عمل تفكيك نمونه‌ها برحسب ادرار، خون، مدفوع و … و مطابقت دادن آنها با list كاري روزانه صورت مي‌گيرد. سپس نام، نام خانوادگي، تاريخ و شماره پذيرش نمونه در دفتر ميكروشناسي ثبت مي‌شود. سپس نمونه‌ها در محيط‌هاي كشت مربوطه كشت داده شده و در موارد لازم اسمير
هم تهيه مي‌شود كه با رنگ گرم يا رنگ آميزي هاي مناسب ديگر رنگ مي‌شوند و پس از بررسي با ميكروسكوپ در دفتر ميكروشناسي گزارش مي‌گردد.
سپس محيط‌هاي كشت داده شده به مدت 24 ساعت در انكوباتور 35 درجه نگهداري مي‌شوند و پس از اين مدت بررسي شده و در صورت عدم رشد تا 48 ساعت نگهداي شوند و در صورت وجود رشد كارهاي تكميلي مثل محيط‌هاي افتراقي و انجام آنتي بيوگرام براي آنها صورت مي‌گيرد.
يادآوري 1: قرائت ابتدايي را بايد روي همه كشتهايي انجام داد كه قبل از نيمه شب دريافت شده‌اند براي كشتهايي كه بعد از نيمه شب پذيرش شده اند مي‌توان اولين قرائت را به همراه ساير كشتهاي ارسالي در روز بعد انجام داد. نحوة كشت نمونه ادرار: به طور معمول كشت ادرار رویي محيط‌هاي آگار خون دار، EMB يا مكانكي آكار انجام مي‌شود. زماني كه ادرار را با استفاده از روشهاي جراحي يا سوپراپوبيك يا با روش سيستوسكوپي يا ماساژ پروستات جمع‌آوري نموده‌اند يا در مواردي كه شك نسبت به ارگانيسم‌هاي سخت رشد در نمونه ادرار وجود دارد، علاوه بر محيط‌هاي فوق از محيط شكلات آگار نيز استفاده مي‌‌شود. براي كشت ادرار مي‌توان از لوپ كاليبره 01/0 يا 001/0 ميلي ليتري استفاده كرد. لوپ استاندارد را پس از استريل كردن و خنك كردن و تماس با ادرار روي محيط‌هاي ذكر شده برده كشت داده و در اتو 35درجه مي‌گذاريم . كلني‌هاي حاصل از رشد باكتري‌ها در محيط كشت را مي‌شماريم و در ضريب حجم لوپ ضرب مي‌كنيم نتيجه به صورت واحد شمارش كلني باكتري در ميلي ليتر ادرار بيان مي‌شود (CFU/ml)
يادآوري 2: چنانچه در كشت ادرار بيمار مقدار زيادي باسيل گرم مثبت ديده شد نيازي به كارهاي بيشتر ندارد چون آلودگي است و لاكتو باسيل است و در صورت رعايت بهداشت آلودگي برطرف مي‌شود. كشت خون: پس از دريافت شيشه كشت خون توصيه مي‌شود كه با يك سر سوزن استريل در كنار شعله در زير هود پس از ضد عفوني با الكل و خشك شدن درپوش لاستيكي، يك مجراي تبادل هواي موقتي (vent) ايجاد شود تا خلاء موجود در شيشه كشت خون جبران يا فشار هواي اضافي درون آن خارج شود و شرايط مناسب براي رشد اركانيسم‌هايي كه به شرايط هوازي نياز دارند مانند: سودوموناس، مخمرها و N.meningitidis ايجاد شود.
يادآوري 3: پس از چند ثانيه سرسوزن را از درپوش لاستيكي خارج مي‌كنيم. انكوباسيون در35 درجه سانتيگراد و حداقل به مدت يك هفته صورت مي‌گيرد. در موارد شك به اندوكارديت حداقل بمدت دو هفته و قارچ‌ها بيش از
دو هفته نگهداري مي‌شوند. در موارد شك به بروسلا به مدت 6-4 هفته نگهداري مي‌شوند.
ترجيحاً در 24 ساعت اول شيشه‌هاي كشت خون چند بار تكان داده شوند. پس از 18-6 ساعت اولين كشت از محیط کشت خون (حدود 25/0 سي‌سي) روي محيط شكلات آگار انجام مي‌شود. محيط را در CO2 گذاشته و براي مدت 5-3 روز از نظر رشد بررسي مي‌شود. مي‌توان در زمان كشت يك قطره از محيط را روي لام نو قرار داد و پس از خشك شدن در زير هود و كنار شعله با متانول فيكس كرد و با رنگ گرم يا متيلن بلو رنگ آميزي كرد.
در صورت مثبت بودن ورد احتمال آلودگي لام، نتيجه تلفني به پزشك اطلاع داده شود. نوبت دوم كشت (subculture) بين 72-48 ساعت بسته به شرايط بيمار توصيه مي‌شود. كشت پس از 7 روز در بعضي از منابع توصيه نمي‌شود، ولي انجام دادن آن ارجح است و احتمال جداسازي باكتريهاي دير رشد، سخت رشد و قارچ ها را زياد مي‌كند. طي مدت 7 روز و پس از آن شيشه‌هاي كشت خون بايد به صورت ماكروسكوپي از نظر علائم رشد شامل كدورت، ليز شدن، ايجاد گاز و ايجاد كلني باكتري (اغلب در گرم مثبت‌ها) بررسي شود.
در ميان اين موارد، كدورت قابل اعتمادترين مشخصه است و ساير موارد مانند ليز شدن به علت سرعت تخليه خون از سوزن يا ايجاد گاز در شيشه‌هاي vent نشده كه ممكن است به فشار اولية محيط مربوط باشد، چندان قابل اعتماد نيست. همچنين تعدادي از ارگانيسم‌ها مانند N.meningitides و هموفيلوس معمولاً كدورت ايجاد نمي‌كنند. در موارد شك به گرم منفي‌هاي روده‌اي يا غير تخمير كننده‌ها مانند سودوموناس مي‌توان براي subculture از محيط مكانكي در كنار محيط شكلات استفاده كرد. در زمان استفاده از محيط‌هاي دوفازي در روز  اول 2 بار و در روزهاي بعد با فواصل 3-1 روز به آرامي با كج كردن بطري براي چند لحظه، فاز مايع را با تمام سطح جامد تماس داد و پس از 72-24 ساعت، سطح محيط جامد را از نظر وجود كلني بررسي كرد. با اين عمل subculture در خود محيط انجام مي‌شود. يادآوري 3: در نوع مرسوم و متعارف در شيشة كشت خون اغلب از محيط‌هاي كشت مايع Trypticase Soy Broth (TSB) و Brain-Heart Infusion (BHI) استفاده مي‌شود. در نوع دوفازي Biphasic يا Castaneda از فرم آگار محيط‌هاي فوق براي فاز جامد استفاده مي‌شود. محيط‌هاي دو فازي بهترين محيط براي جداسازي بروسلا و قارچها هستند.  
گزارش و تفسير:
گزارش شفاهي (Verbal Report): هر زمان كه كشت خون مثبت شد، نتيجه بايد تلفني به پزشك اعلام شود بايد توجه داشت ميزان مرگ و مير موارد سپتي سمي حاد كه به Septic shock منجر مي‌شود، 40-20 درصد است.
گزارش كتبي (Written Report): جواب كشت مثبت يا منفي پس از مدت معين است مانند: NO growth after 7 daysدر موراد كشت خون مثبت زمان جدا شدن قيد شود. به خصوص كشت‌هاي مثبت با استافيلوكوكهاي كواگولاز منفي، زيرا سرعت جداسازي علاوه بر سيستم مورد استفاده مانند سيستم‌هاي خودكار كه در جداسازي تعداد كم اين باكتري حساسيت بالايي دارند با تعداد باكتري در ارتباط است و در مواردي كه تعداد باكتري در خون بالاتر باشد و كشت سريعتر مثبت شود، عفونت واقعي محتمل‌تر است.
يادآوري4: بايد توجه داشت كه در حال حاضر استاف‌هاي كواگولاز منفي شايعترين باكتريهاي جدا شده از
كشت خون و در عين حال شايعترين آلوده كننده‌ هاي كشت خون هستند. در شرايط استاندارد و استفاده از نمونه گيرهاي ورزيده در حدود 3 درصد كل كشت‌هاي خون گرفته شده از بيماران آلوده مي‌شوند (3 مورد آلودگي در هر 100 شيشه كشت خون گرفته شده است). همچنين، حدود نصف كل كشت‌هاي خون كه مثبت شده‌اند، به علت
آلودگي است.در مواردي كه فقط يك بار كشت خون انجام شود يا در يك نوبت كشت از چند نوبت كشت خون انجام شده آلوده كننده‌هاي شايع جدا شود، احتمال آلودگي زياد است و پس از گزارش باكتري جمله A Probable Contaminant قيد مي‌‌شود. در اين موارد به آزمايش تعيين حساسيت ميكروبي نياز نيست. مگر به درخواست پزشك.دو كشت خون مثبت در طول 48 ساعت با استرپتوكوك گروه ويريدانس با ارزش است. دربارة استاف‌هاي كواگولاز منفي، با توجه به وضعيت باليني بيمار، گاهي براي تأييد عفونت واقعي به 4-3 كشت خون مثبت نياز است. كشت زخم براي تلقيح محيط‌هاي جامد مانند بلادگار- شكلات آگار و مكانكي آگار بايد از يك روش استاندارد استفاده نمود تا بتوان آناليز نيمه كمي را روي آن انجام داد.
روش كشت خطي براي جداسازي نيم کمی كلني‌ها است براساس اين روش رشد ضعيف و محدود كلني ها در منطقه اول (پليت) به صورت light Growth (1+). رشد متوسط تا منطقة دوم رشد به صورت Moderate Growth (+2) و بالاخره رشد زياد كه كل پليت توسط كلني‌ها پوشيده شده باشند به صورت Heary Grawth (3+to4+) گزارش مي‌شود. محيط‌هاي تلقيح شده بايد در دماي 35 درجه نگهداري شوند. محيط شكلات آگار را بايد در شرايط %CO2 5-3 نگهداري نمود. بطور كل، انكوباسيون محيطهاي كشت هوازي به مدت 72 ساعت براي موارد معمول و در صورت شك و باكتريهاي سخت رشد مانند نوكارديا ادامه انكوباسيون به مدت 7-5 روز ضروري است. پس از انكوباسيون براي مدت 48-24 ساعت غالباً باكتريهاي شايعي چون استافيلولوك اورئوس، سودوموناس آئروژنوزا و استرپتوكوك بتا هموتيك رشد مي‌كنند. آنتي بيوگرام فقط روي باكتريهايي انجام مي‌شود كه به طور غالب در محيط كشت هوازي رشد كرده‌اند. در صورتي كه كشت هوازي منفي بود، اما زخم عفوني به نظر مي‌رسيد، شك به عفونت بي‌هوازي مطرح است و بايد كامل بررسي شود. رنگ آميزي گرم روي نمونه زخم انجام مي‌شود و در صورت مشاهده لكوسيت بالا، باكتري غالب از نظر شكل مورفولوژيك در لام، به صورت گزارش ابتدايي به پزشك اعلام مي‌شود (براي مثال، كوكسي گرم مثبت زنجيره‌اي).
يادآوري 5:  آبسه‌ها را روي بلاد آگار و مكانكي برده پس از ايزوله كردن داخل اتو مي‌گذاريم سوآپ مربوطه را داخل محيط تايو (در صورت موجود بودن) برده و در داخل اتو 35o مي‌گذاريم چون ممكن است باكتري بي‌هوازي داشته باشند، بهتر است يك لام مستقيم گرفته شده و با كشت مقايسه كنيم.
كه اگر در لام مستقيم 2 جور باكتري ديده شد و در كشت يك نوع رشد كرده بود به عنوان بي هوازي گزارش مي‌شود (يكي از دوتا) ترشحات چشم- گوش- بيني- مجرا- واژن- پوستولهاي بدن: اين نمونه‌ها را حتماً كشت مستقيم داده و ايزوله مي‌كنيم (روي بلاد آگار و مكانكي آگار)
يادآوري6: در مورد مجرا حتماً روي شكلات آگار كشت مي‌دهيم و سوآپ مربوط را داخل محيط تايو مي‌بريم و يك لام نيز تهيه مي‌كنيم. نحوة كشت نمونه مدفوع: با سوآپ مقداري از مدفوع را برداشته و روي محيط SS برده و با آنس ايزوله مي‌كنيم سپس سوآپ مربوطه را داخل محيط S.F مي‌بريم و پليت و لوله را داخل اتو 35o مي‌گذاريم. براي نمونه‌هاي اسهالي چون مستقيماً باسيل از بيمار دفع مي‌شود نيازي به محيط SF  نمي‌باشد و مستقيم روي xLD مي‌بريم. اما براي نمونه‌هاي غيراسهالي نياز به SF است كه مي‌توان xLD اوليه را حذف نمود و روي SF برد و فردا روي xLD ميبريم كه باكتريهاي مهم براي ما سالمونلا، شيكلا و يرسينيا است كشت روي بلاد آگار جهت استاف‌هاي پاتوژن‌مي‌باشد كه دورة‌بيماري 48 ساعت است و پس از اين مدت علائم بيماري برطرف مي‌شود (بطور خود بخود) در اين مدت تنها تجويز آب كافي مي‌باشد. كشت حلق: باسوآپ استريل نمونه را برداشته و روي محيط بلادآگار برده و بعد از ايزوله كردن داخل اتو 35o مي‌گذاريم و يك لام نيز تهيه مي‌كنيم. ترشحات سينوس- بيني: اين ترشحات را پس از كشت مستقيم روي محيط بلاد آگار به محيط تايو (در صورت موجود بودن) منتقل مي‌كنيم. كشت خلط: نمونه را روي بلاد آگار و مكانكي برده پس از ايزوله كردن داخل اتو 35o گذاشته و يك لام هم تهيه مي‌كنيم.
اگر WBC در رنگ آميزي گرم خلط ديده نشود، اما سلولهاي اپي تليال به صورت غالب وجود داشته باشند، در اين صورت اسمير را از نظر ارگانيسم‌ها بررسي نكنيد. اگر نمونه محتوي WBC باشد اسمير را با عدسي 100 بررسي كنيد. بر مناطقي تمركز كنيد كه ميزان WBC بالا دارد و از مناطقي اجتناب كنيد كه آلودگي با فلور ناحيه حلقي- دهاني دارد. – ارگانيسم غالب:
اگر يك ارگانيسم در نواحي با تعداد زياد WBC، غالب باشد، آن را گزارش كنيد. براي مثال، اكر باسيل گرم منفي غالب است گزارش كنيد: Gram-negative bacilli; predominant organism seen on gram stain همچنين اگر اشكال ديگري از باكتريها در اسمير حضور دارند اضافه كنيد: Mixed bacterial morphotypes also
present on gram stain
بدون ارگانيسم غالب:
اسميرهايي كه هيچ ارگانيسم غالبي در نواحي با WBC زياد نشان نمي‌دهند يا بيشتر از يك نوع ارگانيسم در منطقه وجود دارد، به عنوان : Mixed bacterial morphotypes seen on Gram stain گزارش مي‌شود. اگر فقط يك نوع ارگانيسم ديده شود، مورفولوژي رنگ آميزي گرم را گزارش و ارگانيسم را شمارش كنيد. براي مثال:                      Many, Moderate, Few بدون ارگانيسم: اسميرهايي كه هيچ ارگانيسمي در آن ديده نمي‌شود به اين صورت گزارش شوند:   No organisms seen
دستورالعمل نگهداری نمونه هایی که امکان کشت سریع آنها وجود ندارد نمونه های رسیده به آزمایشگاه جهت کشت حداکثرظرف 2 ساعت بایستی کشت داده شوند و در ردیف کار روتین قرار گیرند.اگر امکان کشت سریع نبودبه ترتیب زیر عمل شود:نمونه ادرار در حرارت یخچال ͨ°4-2 حداکثر به مدت 2 ساعت .نمونه سواپ گرفته شده از زخم )به جز موارد بی هوازی( ، ترشحات واژن ، خلط ، مقعد و همچنینن نمونه مدفوع را می توان به مدت 3-2 ساعت درون یخچال ͨ°4-2 نگهداری کرد و سپس کشت نمود.تنها در صورتی که نمونه Formed باشد می توان درون یخچال ͨ°4-2 ،24 ساعت نگهداری شود .در مواردی که نمونه Loose می باشد پس از بررسی شکل ظاهری و دید مستقیم می توان از فرمالین 10% برای تثبیت آن استفاده کرد.
دستورالعمل رنگ آميزي گرم مواد مورد نیاز : کیت رنگ آمیزی
لوازم موردنیاز :  لام، جار رنگ آمیزی، لوپ
شرح انجام : تهيه لام ميكروبي از نمونه فيكس كردن لام ميكروبي توسط حرارتاضافه كردن كريستال ويوله به لام ميكروبي به مدت 1 دقيقه وسپس شستشوي لاماضافه كردن لوگل به لام ميكروبي به مدت 1 دقيقه و سپس شستشوي لاماضافه كردن اسيدالكل به لام ميكروبي به مدت 15 دقيقه و سپس شستشوي لاماضافه كردن سافرانين به لام ميكروبي به مدت 45 ثانيه و سپس شستشوي لامخشك كردن لام ومشاهده باعدسي 100 ميكروسكوپ
نحوه کنترل کیفیت : با استفاده از یک سوش معلوم رنگ آمیزی مورد بررسی قرار می گیرد. در صورت عدم دریافت جواب مناسب نوع رنگ و روش انجام مورد بازبینی قرار  می گیرد که در نهایت می بایست نمونه گیری مجدد پس از رفع ریشه عدم انطباق صورت گیرد.
  کنترل کیفیت رنگ ها و روش رنگ آمیزی
– کیت ها و معرف های مربوط به رنگ آمیزی بایستی هر هفته و با ورود یک Lot جدید از نظر تاریخ انقضا ، شرایط نگهداری مورد ارزیابی قرار گرفته و نتایج ثبت گردد.
– برای ارزیابی و کنترل کیفی رنگ ها به ویژه رنگ آمیزی گرم هر هفته توسط این رنگ دو باکتری استاندارد  یکی  اشرشیا  کولی ATCC25922 به عنوان باسیل گرم منفی و استاف اورئوس ATCC25923 به عنوان کوکسی گرم مثبت رنگ شده و از نظر نوع رنگ آمیزی :
–  فیکس شدن قبل از رنگ آمیزی ( استفاده از الکل متانول  و یا حرارت)
– گرم منفی و گرم مثبت بودن
-تثبیت کردن ید در گرم مثبت ها
– از نظر رنگ بری ( الکل استن)
– از نظر رنگ زمینه سافرانین و یا فوشین و …
ارزیابی می شود و نتایج آن ثبت می گردد.
– برای سایر رنگ ها نیز مثل آلبرت و یا اسپور بایستی از سویه های مورد نظر مثل باسیل دیفتری و یا باسیلوس ها درصورت در دسترس بودن استفاده کرد.  
کنترل کیفیت معرف ها ، تست ها و محیط های شناسایی و تشخیصی
 – برای ارزیابی تمامی معرف ها ، تست ها و محیط های تشخیصی بهتر است در هر ران کاری که از این موارد استفاده می شود کنترل های  مثبت و منفی نیز استفاده گردد و نتایج آن در کنار نتایج بیماران ثبت گردد .
به عنوان مثال در باکتری های گرم مثبت تست های کاتالاز، کوآگولاز ، DNase  ، هیدرولیز هیپورات ، تست CAMP ، حساسیت به دیسک های  تشخیصی  و یا  در باکتری های گرم منفی  تست های MR، VP ،  سیترات ،  اکسیداز ،  اندول و …  تمامی  تست هایی که ازمعرف ها ، دیسک های تشخیصی و محیط های تشخیصی استفاده می شود یک نمونه کنترل منفی و یک نمونه کنترل مثبت نیز در کنار نمونه مجهول کار و نتایج ثبت گردد .
 
تهیه نمونه های کنترل منفی و مثبت در مورد هر تست:
1- خرید و استفاده از سویه های استاندارد (ATCC) که نتایج آنها در مورد هر یک از این تست ها مشخص است.
2- نگهداری و استفاده از باکتری ها و سویه هایی که نتایج آنها در مورد هر تست قبلا مثبت و منفی تشخیص داده شده به عنوان کنترل مثبت و منفی در هر ران کاری . ( به عنوان مثال اگر باکتری استاف اورئوس جدا شده که از نظر کوآگولاز ، کاتالاز، DNase مثبت بوده است این سویه نگهداری شده و در هر ران کاری به عنوان کنترل مثبت انجام شود و یک باکتری که از نظر تست های فوق منفی است نیز به عنوان کنترل منفی )
– لازم به ذکر است که برای این نوع کنترل بهتر است از سویه های استادارد که نتایج تست های آنها کاملا مشخص است استفاده گردد.
– در آزمایشگاه تشخیص طبی میلاد سویه های استاندارد ATCC ( استاف اورئوس ، سودموناس آئروژینوزا ، انتروکک و اشرشیاکولی) موجود بوده و در مورد تست هایی که در این باکتری ها مثبت و منفی است از این باکتری ها به عنوان کنترل استفاده می شود . به عنوان مثال سودموناس اکسیداز مثبت و اشرشیا اکسیداز منفی است و به عنوان کنترل تست اکسیداز استفاده می شوند.
– معرف ها محیط ها و دیسک های تشخیصی نیز بایستی ماهانه و با ورود هر Lot از نظر نگهداری تاریخ انقضا و … ارزیابی و نتایج آنها ثبت شود.
– محلول ها یی که در آزمایشگاه توسط پرسنل فنی این بخش ساخته می شوند از نظر شرایط نگهداری نوع ماده شیمیایی تاریخ نگهداری و … بایستی لیبل زده شوند.
نکته : فقط اگر معرف ها ، آنتی سرم ها و محیط های کشت تاریخ گذشته ( بجز محیط مولر هینتون آگار ) بطور مستمر کنترل کیفی شوند و نتایج قابل قبولی داشته باشند ، قابل استفاده می باشند. توجه : محیط مولر هینتون آگار ، دیسک های آنتی بیوتیکی و دیسک های تشخیصی تاریخ گذشته به هیچ عنوان قابل استفاده نمی باشند.  


دستورالعمل انجام افتراقی برای شناسایی باکتری مواد مورد نیاز :
محيط هاي افتراقي ( سيمون سيترات ،SIM ,  TSI   ، MRVP   اوره ، لايزين دكربوكسيلاز  ( لوزام موردنیاز : آنس ، چراغ الکل، لام
شرح انجام : جهت انجام آزمايش افتراقی‌بايستي توسط آنس نوك تيز از يك كلني تك كه غالب كلني هاي رشد كرده در محيط كشت مي باشد، برداشت كرده و ابتدا در محيط سيمون سيترات بصورت سطح كشت مي دهيم سپس با همين آنس روي محيط TSI به روش عمق كه به انتها نرسد و سپس سطوح انجام مي دهيم بعد با همين آنس روي محيط Motility جهت بررسي حركت بصورت مستقيم از عميق كشت مي دهيم. آنس را سپس استريل كرده از همان كلني به مقدار بيشتري نمونه برداشت كرده و روي محيط اوره و با برداشت مجدد روي محيط MR VP‌كشت داده و باكتري را در آن حل مي كنيم ومقداري از باكتري را در محيط لايزين دكربوكسيلاز كشت داده وسپس همه محيط ها را در حرارت º 37 به مدت 24- 16 ساعت قرار مي دهيم و نتايج را از روي جدول مقايسه و بررسي مي كنيم.     تعیین حساسیت میکروبی (آنتی بیوگرام)
  مواد مورد نیاز : دیسک های آنتی بیو گرام ، محیط مولر هینتون لوازم موردنیاز : پنس، شعله گاز، سواپ استریل شرح انجام : روشهای مختلفی برای تعیین حساسیت باکتریها نسبت به آنتی بیوتیکها وجود دارد مثل روشMIC و روش Disk diffusion که در این روش مقدار مشخصی از آنتی بیوتیک بر روی هر دیسک قرار داده شده که پس از قرار دادن در سطح محیط مولرهینتون ،آنتی بیوتیک موجود در دیسک در داخل محیط نفوذ کرده و باعث جلوگیری از رشد باکتری مورد آزمایش می گردد. ابتدا بایستی از کلنی مورد آزمایش کدورت استاندارد(5% مک فارلند) تهیه کرد که به دو طریق امکان پذیر است .یکی اینکه توسط لوپ از قله 3 تا 4 کلنی مشابه برداشت کرده و داخل یک لوله حاوی سرم فیزیولوژی به صورت سوسپانسیون در آورده تا کدورتی به اندازه کدورت لوله استاندارد به دست آید.
در روش دوم مقداری از کلنی مورد آزمایش را در لوله حاوی محیط کشت TSB وارد کرده و سپس آنرا در حرارت c°37   به مدت 4-2 ساعت قرار می دهیم تا زمانی که کدورت آن به اندازه کدورت لوله استاندارد شود .اگر سوسپانسیون رقیقتر باشد قطر هاله عدم رشد بزرگتر و اگر غلیظ تر باشد قطر هاله عدم رشد کوچکتر خواهد شد. بعد فروبردن سواپ استریل در سوسپانسیون میکروبی ، اضافه محلول را با فشار دادن سواپ به کناره لوله گرفته وسپس در سطح پلیت 3 بار در حالت زاویه 60 درجه نسبت به هم می مالیم و در آخر سواپ را در قسمت داخلی پلیت چرخانده و سپس سواپ را داخل ماده ضدعفونی کننده قرار میدهیم .حداکثر تا 10 دقیقه پس از این کار بایستی دیسک گذاری انجام شود .برای این کار از پنس استفاده ، پس از دیسک گذاری با نوک پنس روی دیسکها را کمی فشار داده تا به سطح پلیت کاملاً بچسبند.
پلیتها را در حرارت    c °37   به مدت 24 ساعت قرار داده سپس با استفاده از یک خط کش دقیق قطر هاله عدم رشد را بر حسب میلی متر اندازه گیری می کنیم .سپس با استفاده از جدول  NCCLSدیسک مورد نظر به صورت S(حساس)،I (نیمه حساس)،R(مقاوم) گزارش می کنیم. نکات قابل توجه قبل از انجام آنتی بیوگرام دیسکها بایستی به حرارت اتاق برسند .تاخیر زیاد بین قرار دادن دیسکها و انکوباسیون در دمای c °37   سبب ایجاد خطا در نتیجه آزمایش می شوند .برای تعیین حساسیت باکتری های سخت رشد می توان با افزودن 5% خون به محیط مولرهینتون نسبت به آنتی بیوگرام  این باکتریها اقدام نمود.
دیسکهای ذخیره در حرارت 20- درجه و دیسکهای مصرفی در یخچال 8-2 درجه سانتیگراد نگهداری می شوند. نکته : دمای مناسب برای نگهداری دیسک های آنتی بیوتیکی ذخیره ، کمتر از 14- درجه سانتیگراد و برای مصرف روزانه در یخچال 2 تا 8 سانتی گراد می باشد. نکته : باکتری های سخت رشد نظیر استرپتوکوک ها به ویژه استرپتوکوک پنومونیه ، هموفیلوس آنفولانزا ، نیسریا مننژیتیدیس و نیسریا گونوره برای رشد خود نیاز به CO2 دارند. 
تعیین حساسیت باکتریها نسبت به آنتی بیوتیک مواد مورد نیاز :
دیسک های آنتی بیو گرام ، محیط مولر هینتون لوازم موردنیاز: پنس، شعله گاز، سواپ استریل
شرح انجام : برای تعیین حساسیت باکتریها نسبت به آنتی بیوتیک از روش Kirby & Bauer اصلاح شده بر اساس رهنمودهای CLSI  استفاده کنید. محیط کشت نوع محیط کشت در اندازه هاله عدم رشد و میزان نفوذ آنتی بیوتیک تاثیر بسزایی دارد. محیط مولر هینتون آگار به عنوان محیط انتخابی برای آزمایش بکار می رود. چون میزان عوامل مهارکننده سولفانامیدها و تری متوپریم و تتراسایکلین در آن کم بوده و همچنین مقدار کاتیونهای ⁺⁺⁺Ca  و ⁺⁺ Mg موجود در آن تنظیم شده می باشد. PH محیط در حرارت اتاق (25 درجه سانتی گراد) باید بین 4/7 – 2/7 باشد. پس از اتوکلاو محیط را سریعا باید به دمای 50 – 45 درجه برسانید و در پلیت 10 سانتی متر به عمق 4 میلی متر بریزید و پس از بستن محیط آنها را در حرارت 37 درجه سانتی گراد به مدت 30 – 10 دقیقه قرار داده و سپس آنها را در کیسه نایلونی کاملا دربسته در یخچال نگهداری کنید. این پلیت ها باید تا 7 روز پس از تهیه مصرف شوند و در هر سری ساخت محیط مولر 2 – 1 پلیت را در 35 – 30 درجه سانتی گراد به مدت 24 ساعت برای کنترل استریل بودن آن قرار دهید. دیسکهای آنتی بیوتیک این دیسکها از کاغذهایی با کیفیت بالا و با غلظت مشخص از آنتی بیوتیک  بطور استاندارد تهیه شده اند. دیسکهای ذخیره باید در حرارت 20- درجه سانتی گراد و دیسکهای مصرفی در یخچال 8-2 درجه سانتی گراد نگهداری کنید.
نگهداری دیسکها در حرارت بالاتر باعث افت قدرت دیسکها شده و جواب مناسبی نخواهید گرفت.              
تهیه کدورت استاندارد برای تهیه کدورت استاندارد 5/0 میلی لیتر از محلول 175/1 درصد کلرور باریم با 2 مولکول آب را در یک بالن ژوژه 100 میلی لیتری ریخته و با اسید سولفوریک 1% حجم را به صد میلی لیتر برسانید. این محلول در حرارت اتاق و در تاریکی به مدت 6 ماه پایدار است. برای جلوگیری از تبخیر درب لوله را محکم ببندید. این محلول را در لوله ای که هم قطر لوله تهیه سوسپانسیون میکروبی شماست بریزید و نگهداری کنید.
تهیه سوسپانسیون میکروبی:  (همیشه از کشت خالص استفاده کنید) این سوسپانسیون را می توان به دو طریق تهیه نمود.
الف) به کمک سوآب از قله 4-3 کلنی میکروبی برداشت کرده و داخل یک لوله حاوی سرم فیزیولوژی بصورت سوسپانسیون درآورده تا کدورتی به اندازه کدورت لوله استاندارد بدست آید.
ب )مقداری از کلنی مورد آزمایش را در لوله حاوی محیط کشت TSB وارد کرده و سپس آنرا در اتو 35 درجه سانتی گراد به مدت 4-2 ساعت قرار دهید تا زمانی که کدورت آن به اندازه کدورت لوله استاندارد برسد در آن هنگام برای کشت استفاده خواهدشد. اگر سوسپانسیون رقیق باشد قطر هاله عدم رشد بزرگتر و اگر غلیظ تر از استاندارد باشد هاله عدم رشد کمتری خواهید گرفت (بدون اینکه حساسیت ارگانیسم تغییری کرده باشد) مرحله دیسک گذاری بعد از فرو بردن سوآب استریل در سوسپانسیون میکروبی اضافه محلول را با فشار دادن سوآب به کنار لوله، گرفته و سپس در سطح پلیت سه بار درحالت زاویه 60 درجه نسبت به هم می مالیم و در آخر سوآب را دور قسمت داخلی پلیت چرخانده و سپس داخل ماده ضدعفونی کننده قرار دهید. اگر پلیت ها بعد از کشت مدت زیادی در حرارت اتاق بماند تکثر باکتری قبل از دیسک گذاری انجام شده و هاله عدم رشد کمتری خواهید گرفت. با استفاده از دیسپنسر یا انبرک مخصوص و یا پنس دیسکها را در سطح محیط کشت قرارداده و با نوک پنس آنها را درجای خود محکم کنید.حداکثر 7 دیسک را روی پلیت قرار دهید. پلیت ها را در حرارت 35 درجه سانتی گراد به مدت 18 – 16 ساعت قرارداده و پس از آن با استفاده از خطکش دقیق قطر هاله عدم رشد را بر حسب میلیمتر اندازه گرفته و با استفاده از جدول، میزان حساسیت باکتری را نسبت به آنتی بیوتیک بصورت حساس – نیمه حساس و مقاوم گزارش نمایید.
توجه:
الف) برای کنترل دیسکها می توانید از سوش های استاندارد و جدول مخصوص آن استفاده کنید. برای تهیه آنها می توانید با شرکت تماس حاصل فرمایید.
ب) دیسکهای مورد نظرتان را 2-1 ساعت قبل از انجام آزمایش از یخچال بیرون آورده تا به حرارت اتاق برسند و پس از مصرف بلافاصله به یخچال باز گردانید.
ج)دقت آزمایش بستگی به قدرت دیسکها – نحوه صحیح کشت – نوع محیط کشت و عمق آن دارد. د) برای اینکه قدرت دیسک کاسته نشود حتما شرایط ذخیره و نگهداری که قبلا توضیح داده شده (ذخیره دیسک در 20- درجه سانتی گراد و نگهداری دیسک مصرفی در 8 – 2 درجه سانتی گراد باید رعایت شود
ه) دیسکها را از نمایندگی و یا شرکت هایی که زنجیره سرد را رعایت میکنند تهیه فرمایید.
و) هر سری محیط کشت مولر هینتون را طبق روش آزمایشگاه رفرانس کنترل کنید
.    
   1/Bauer, Kirby Sherris & Turck 1966 Am.j clin path. 45: 493.            2/ Performance Standards For antimicrobial kisk Susceptibility Tests, Nccls   دستورالعمل تشخیص باکتریهای گرم مثبت شرح انجام :
جهت بررسی و تشخیص نمونه های+gr که روی بلادآگار رشد کرده اند ابتدا یک لام تهیه شده و رنگ آمیزی گرم شود.سپس تست کاتالازانجام می شود تا  Staph یاStrept بودن نمونه مشخص شود.در صورت مثبت بودن کاتالازو Staphبودن نمونه مراحل بعدی به قرار زیر است.همزمان از نمونه فوق روی محیط مانیتول برده و تست کواگولاز نیز انجام می شود .هردو نمونه د ر  c°37 قرار گرفته لوله کواگولاز بعد از دو ساعت از نظر بسته شدن درون لوله بررسی می شود. در صورت مثبت بودن تست کواگولاز و رشد روی محیط مانیتول نمونه فوق +  Staph Coagulaseیا Staph Aureus می باشد .
در صورت منفی بودن تست کواگولاز بایستی مراحل تشخیص ادامه یابد.جهت غربالگری استافیلوکوکهای کواگولاز منفی از دیسک نووبیوسین 5 میکروگرمی استفاده می شود. با سواپ روی نصف یک پلیت بلادآگار کشت کرده یک دیسک نووبیوسین روی آن گذاشته با پنس کمی روی آن فشار میدهیم تا تماس کامل شود بعد از 24 ساعت انکوبه کردن در c°37 بررسی می کنیم .S.Saprophyticusبه نووبیوسین مقاوم بوده یا هاله عدم رشد کمتر از 12 میلی لیتر ایجاد می کند.S.Epidermidisبه نووبیوسین حساس بوده و هاله عدم رشد 16 میلی لیتر یا بزرگتر ایجاد میکند.
در صورتی که لام گرم و تست کاتالاز، استرپتوکک بودن نمونه را تائید کنند مراحل کار به قرار زیر است :
ازنمونه فوق روی بلادآگار یا مولرهینتون آگار برده ، دیسک با سیتراسین 4% واحد روی آن گذاشته درونc°37 قرار داده بعد ا ز24 ساعت از نظر هاله عدم رشد بررسی می شود. در صورت وجود میکروکک ها عدم رشد 10< میلی متر مشاهده می گردد.جهت بررسی و افتراق استرپتوکک بتاهمولتیک گروهA  از سایر استرپتوکک ها از دیسک با سیتراسین به همراه دیسک SXT روی بلادآگار یا مولرهینتون استفاده می شود.بهتر است برای انجام آزمایش تعیین حساسیت ضد میکروبی استرپتوکوک ها خصوصا استرپتوکوک پنومونیه و نیز نیسریا مننژیتیدس استفاده شود.استرپتوکک Bهمولتیک گروه A به با سیتراسین حساس و به SXTمقاوم است .
استرپتوکک Bهمولتیک گروه Bبه هردو آنتی بیویک مقاوم است .
  نحوه نگهداري سويه هاي باكتري:
براي نگهداري سويه‌هاي باکتريايي مي‌توان از  روشهاي طولاني مدت و کوتاه مدت استفاده نمود.
نگهداري طولاني مدت نگهداري طولاني‌مدت باکتريها اين امکان را مي‌دهد که کليه سويه‌هاي ميکروبي اعم از هوازي (بارشد سريع ويا سخت رشد) و نيز بي هوازي ، ماهها و حتي سالها به صورت زنده نگهداري شوند.
بهترين روشهاي نگهداري طولاني مدت شامل ليوفيليزاسيون (Freeze drying) و نگهداري در دماي 70- درجه سانتي‌گراد يا پايين تر ( در ديپ فريز يا در نيتروژن مايع ) مي‌باشد.. در صورت عدم دسترسي به فريزر 70- درجه مي توان سويه‌هاي با رشد سريع را در فريزر 20- درجه نيز نگهداري نمود. در اين شرايط توجه به نکات زير ضروري است. سويه‌هاي سخت رشد مانند هموفيلوس انفلوآنزا و نيسريا گنوره در اين دما قابل نگهداري نمي‌باشند و بايد در  فريزر 70- درجه نگهداري شوند.
سويه‌هاي بارشد سريع در اين دما عمر کمي دارند و تعداد زيادتري از آنها از بين مي‌روند.
بنابراين توصيه مي‌شود براي اطمينان از حيات سويه‌ها هر چند ماه ، طبق روش زير کشت داده شوند.
يک ويال از فريزر بيرون آورده و و سريعا زير آب جاری ولرم محتويات آنرا ذوب نمائيد. نمونه را روي محيط آگار خوندار يا شکلاته ( در مورد باکتريهاي سخت رشد ) تلقيح کرده و به مدت 24-18 ساعت در دماي 2±35 درجه ودر صورت نياز در شرايط CO2 انکوبه نماييد. اين باکتري مي‌تواند براي آزمايشهاي کنترل داخلي کيفيت در آزمايشگاه يا براي تهيه working control بکار رود. قبل از هر اقدام بايد از خالص بودن نمونه ، اطمينان حاصل کرد.
ويال مورد استفاده بعد از ذوب شدن بايد دور انداخته شده و بهيچوجه مجددا فريز نگردد. کشتهاي working control :  عبارتست ازکشت مجدد از کشت ذخيره فريز شده که براي کنترل کيفيت محيط کشت و.. استفاده مي‌شود. از کشت ذخيره تا 3 پاساژ پشت سر هم مي‌توان انجام داد . پس از آن ، نمونه بايد دور انداخته شده و از يک کشت ذخيره فريز شده ديگر براي تهيه کشتهاي  working control  استفاده شود. پاساژهاي مکرر( بيش از 3 پاساژ)، احتمال تغيير فنوتيپي سويه‌ها را افزايش مي‌دهد. براي تهيه working control ، از کشت ذخيره فريز شده ، روي پليت يا آگار شيبدار تلقيح  و آنرا به مدت يک شبانه‌روز تا زماني که رشد مناسبي بدست آيد، انکوبه نمائيد. در مورد ارگانيسمهاي با رشد سريع اين پليت يا آگار شيبدار را مي‌توان در 8-2 درجه سانتيگراد يا در دماي اتاق تا مدت 4 هفته نگهداري نمود. بعد از هر پاساژ، خالص بودن و مورفولوژي کلني‌ها را بررسي نمائيد.
2– استفاده از روغن معدني در دماي اتاق :
1- محيط کشت Brain Heart Infusion Agar (BHIA) را با شيب کم در لوله تهيه نماييد.
براي باکتريهاي مشکل‌پسند مانند گونوکک ، مننگوکک ، استرپتوکک پنومونيه و هموفيلوس آنفلوانزا ، لازم است محيط شکلات آگار را با افزودن 5% خون گوسفند به محيط فوق پس از خروج از اتوکلاو و رسيدن به دمای 50 درجه سانتی‌گراد و قرار دادن در بن‌ماري 80 درجه سانتي‌گراد به مدت 15 دقيقه تهيه نمود.
2- روغن معدني ( يا پارافين مايع ) را در حرارت خشک ( 170 درجه سانتي‌گراد به مدت يکساعت ) استريل نمائيد.
3- ميکروب مورد نظر را روي محيط کشت  دهيد.
4- بعد از بدست آوردن کشت کافي ، روغن استريل را به مقدار cc 1 روي سطح محيط بريزيد. 5- در صورت نياز به کشت مجدد ، نمونه از سطح آگار (زير روغن ) برداشته مي‌شود. 6- بعد از 12-6 ماه تجديد کشت نماييد. کشت عمقي و نگهداري در دماي اتاق : اين روش فقط براي باکتريهايي که مشکل‌ پسند نيستند مانند استافيلوکک وخانواده انتروباکترياسه بکار مي‌رود.
يک محيط کشت آگار بدون کربوهيدرات مانند TSA را باعمق زياد در لوله تهيه نماييد.
باکتري را بصورت کشت عمقي در در اين محيط تلقيح نماييد.اين محيط را 24 ساعت در اتو 35 درجه انکوبه نمائيد.در لوله را با درپيچ يا چوب پنبه ببنديد.لوله در پيچ‌دار را در پارافين مايع فرو ببريد به گونه‌اي که کاملا در لوله را بپوشاند.کشتها را در حرارت اتاق نگهداري نمائيد.هرساله سوش موردنظر را تجديد نمائيد.کشت عمقي در محيط سيستين تريپتيکيس آگار (CTA) براي نيسريا و استرپتوکک :محيط CTA را در لوله تهيه نماييد .باکتري را بطو عمقي در اين محيط کشت دهيد.محيط را بمدت 24 ساعت در اتو 35 درجه سانتي‌گراد انکوبه نماييد.در لوله را با چوب‌پنبه يا در پيچ ببنديد.لوله در پيچ‌دار را در پارافين مايع فرو ببريد به گونه‌اي که کاملا در لوله را بپوشاند.براي نيسريا لوله را در 35 درجه نگهداري و هر دو هفته کشت را تجديد نمائيد . براي استرپتوکک لوله را در حرارت اتاق نگهداري کرده و هر ماه تجديد کشت کنيد. نگهداري کوتاه مدت کشتهاي working control  که براي کارهاي روتين روزانه استفاده مي‌شوند ، به روشهاي زير تهيه مي‌شوند: باکتريهاي با رشد سريعسوش مورد نظر را در سطح محيط TSA لوله‌اي درپيچ‌دار کشت دهيد.محيط را بمدت 24 ساعت در اتو 35 درجه سانتي‌گراد انکوبه نماييد.پس از رشد کامل، لوله را در يخچال نگهداري کنيدهر ماه کشت را تجديد نمائيد.§       استرپتوککهاسوش مورد نظر را در سطح آگار خوندار شيبدار( لوله‌اي درپيچ‌دار) کشت دهيد.محيط را بمدت 24 ساعت در اتو 35 درجه سانتي‌گراد انکوبه نماييد.پس از رشد کامل، لوله را در يخچال نگهداري کنيد. ( جهت استرپتوکک پنومونيه ، محيط را در دماي اتاق نگهداري کنيد.)هر ماه کشت را تجديد نمائيد. مننگو‌کک و هموفيلوسسوش مورد نظر را در سطح محيط آگار شکلاته لوله‌اي يا پليت کشت دهيد.محيط را بمدت 24 ساعت در اتو 35 درجه سانتي‌گراد انکوبه نماييد.پس از رشد کامل، لوله را در حرارت اتاق نگهداري کنيدهر2 هفته کشت را تجديد نمائيد. گونوکک  سوش مورد نظر را در سطح محيط آگار شکلاته کشت دهيد.محيط را بمدت 24 ساعت در اتو 35 درجه سانتي‌گراد انکوبه نماييد.نمونه را در دماي 35 درجه نگهداري نماييد.هر2 روز يکبار کشت را تجديد نمائيد.   کنترل کيفيت ديسک هاي آنتي بيوتيک جهت انجام آزمايش تعيين  حساسيت ميکروبي به روش disk diffusion agar
– دیسک های آنتی بیوتیکی بایستی هر هفته و با ورود هر Lot جدید توسط سویه های استاندارد طبق SOP حساسیت آنتی بیوتیکی کنترل و نتایج آن ثبت گردد.   هدف از برنامه کنترل کيفي پايش و ارزيابي موارد زير مي باشد : صحت و دقت روش انجام آزمايش تعيين حساسيت مواد و وسايل به کار برده شده در اين آزمايشعملکرد افرادي که آزمايش را انجام داده و نتايج بدست آمده را قرائت مي نمايند. به منظور دست يابي بهينه به اين اهداف در دسترس داشتن سويه هاي کنترل کيفي تهيه شده از مراکز معتبر ضروري است . سويه هاي کنترل کيفي پيشنهادي توسطCLSI  عبارتند از : Enterococcus faecalis ATCC 29212 Escherichia coli ATCC 25922 Escherichia coli ATCC 35218 Haemophilus influenzae ATCC 49247 Haemophilus influenzae ATCC 49766 Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Staphylococcus aureus ATCC 25923 Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 E.coli ATCC 35218  فقط به عنوان يک ميکروارگانيسم کنترلي براي ترکيبات ممانعت کننده بتالاکتاماز، مثل ترکيبات حاوي کلاولانيک اسيد، سولباکتام يا تازوباکتام پيشنهاد مي شود . Enterococcus faecalis
ATCC 29212  ( يا E.faecalis ATCC 33186 ) براي ارزيابي  محيط مولر هينتون آگار با ديسک تري متوپريم / سولفامتوکسازول استفاده مي شود. درمحيط کشت قابل قبول ، هاله عدم رشد واضحي به قطر mm 20 يا بزرگتر ايجاد مي شود در حاليكه در محيطهاي کشت غير قابل قبول ، هاله عدم رشد ايجاد نمي شود يا در داخل هاله ، رشد کم مشاهده مي شود و يا هاله اي با قطر کمتر از mm 20 ايجاد ميگردد.
اين کار به منظور بررسي مقادير غير قابل قبول  تيميدين در محيط کشت مزبور است . Enterococcus faecalis ATCC 29212    همچنين براي کنترل ديسکهاي آمينو گليکوزيد با دوز بالا به کار مي رود. Klebsiella
pneumoniae ATCC 700603 به عنوان يک سويه کنترلی براي آزمايشات ESBL به کار برده مي شود . کنترل کيفيت قطر هاله عدم رشد سويه کنترلي/ ديسک آنتي بيوتيکي سويه هاي کنترل کيفي  را بايد به روش استاندارد آزمايش  disk diffusionو با استفاده از همان مواد و روشي که براي سويه هاي جدا شده از نمونه هاي کلينيکي استفاده مي شود  آزمايش و نتايج را با جداول 3 و A3 CLSI ( ضميمه 3) مقايسه و بررسي نمود .
محدوده قطر هاله عدم رشد قابل قبول براي هر سويه کنترلي نسبت به يک ديسک آنتي بيوتيکي در جداول فوق فهرست شده است .
چنانچه تغيير در ميانگين قطر هاله عدم رشد ناشي از خطا در روش انجام آزمايش نباشد ، احتمالا” ناشي از تغيير در حساسيت ذاتي باکتري نسبت به آن آنتي بيوتيک مي باشد. در اين صورت لازم است کشت تازه از سوش کنترل تهيه شود . آزمايش کنترل کيفيت  را بايد درچه فواصل زماني انجام داد ؟ الف _ انجام آزمايش روزانه   براي هر سويه کنترلي با يک ديسک آنتي بيوتيکي بايد 20 روز متوالي آزمايش تعيين حساسيت انجام و نتايج با مقادير قابل قبول اشاره شده در جداول فوق مقايسه گردد . بر اساس ضريب اطمينان 95% تنها يک مورد از 20 نتيجه قرائت شده مي تواند خارج از محدوده كنترل باشد ( به ضميمه 2مراجعه کنيد) . چنانچه بيشتر از يک مورد خارج از محدوده کنترل باشد نياز به اقدامات اصلاحي خواهد بود ، که در ادامه توضيح داده مي شود. ب _ انجام آزمايش هفتگي – در صورتيكه تنها يک مورد از 20 نتيجه  قطر هاله عدم رشد براي هر سويه کنترلي/ ديسک آنتي بيوتيکي خارج از محدوده قابل قبول مندرج در جداول 3 و A3( ضميمه 3) قرار گيرد ، کنترل کيفي روزانه را به هفتگي تغيير دهيد( به ضميمه 2 مراجعه کنيد) .
– آزمايش کنترل کيفي هفتگي را يکبار در هفته و هم چنين زمانيکه يکي از عوامل آزمايش (مانند سري ساخت آگار يا ديسکهای تهيه شده از يک سازنده) تغيير کند، انجام دهيد . اگر هر يک از نتايج کنترل کيفي هفتگي خارج از محدوده قابل قبول باشد ، انجام اقدامات اصلاحي مورد نياز است . اقدامات اصلاحي ( Corrective actions) الف – نتايج خارج از محدوده قابل قبول به دليل خطاهاي مشهود و واضح شامل:
استفاده از ديسک اشتباه استفاده از سويه کنترلی اشتباه آلودگي واضح سويه استفاده غيرعمدی از دما و شرايط اشتباه انکوباسيون بوجود آمده است . دراين حال بايد دليل ايجاد خطا مکتوب و پس از اصلاح آزمايش دوباره تکرار شود . اگر نتايج گزارش شده در محدوده مورد نظر قرار گرفت ، عمليات اصلاحي بيشتري مورد نياز نمي باشد . ب – عامل ايجاد نتايج خارج از محدوده کنترل نامشخص است. در اين حال بايد اقدامات اصلاحي فوري بشرح زير انجام شود. آزمايش را جهت يک سويه کنترلي / ديسک آنتي بيوتيکي براي 5 روز متوالي تکرار و همه نتايج را ثبت کنيد . اگر اندازه هر 5 قطرهاله مطابق جداول 3 و A3( ضميمه 3) و در محدوده قابل قبول باشد ، عمليات اصلاحي بيشتري مورد نياز نمي باشد . –        اگر اندازه هر يک از 5 قطر هاله عدم رشد خارج از محدوده قابل قبول باشد ، به عمليات اصلاحي اضافي نياز است . آزمايشهاي کنترلي روزانه بايد ادامه داده شود تا به دليل نهايي مشکل پي برده شود . عمليات اصلاحي اضافي : وقتي عمليات اصلاحي فوري مشکل را حل نکرد ، احتمالا” خطاي مشاهده شده بعلت بروز يك اشکال کلي در سيستم و نه يک خطاي تصادفي ايجاد شده است .
در اين حالت  بايد موارد بيشتري بررسي شوند.مانند: اندازه گيري و ثبت  صحيح قطر هاله هاي عدم رشد رعايت تاريخ انقضا و شرايط نگهداري  ديسکها و مواد مورد استفاده ( دور از رطوبت و در دماي مناسب)- مناسب بودن دما و اتمسفر انکوباتور -تغييرنيافتن يا آلوده نبودن سويه هاي کنترل – مطابقت صحيح سوسپانسيون تلقيح با استاندارد نيم مک فارلند استفاده از پليت کشت تازه برای تلقيح ( پليت کشت بايد تازه بوده و مدت زمان انكوباسيون آن بيشتر از 24 ساعت ، نباشد. ) وقتي مشکل بر طرف شد ، می‌توان کنترل کيفي هفتگي را برقرار کرد.
نگهداري ديسکهاي آنتي بيوتيکي – ديسکها بايد در يخچال˚C 8 و پايين تر ، يا در فريزر˚C 14- و پايين تر تا زمان مصرف نگهداري شوند. – دیسک های آنتی بیوتیکی ذخیره ، کمتر از 14- درجه و برای مصرف روزانه در یخچال 2 تا 8 درجه می باشد . در صورت استفاده از دیسک های قرصی شکل می توان طبق توصیه سازنده عمل کرد. – تمامي ديسکهاي گروه بتالاکتام مانند پني سيلين ، آمپي سيلين ، کربني سيلين ، تيکارسيلين ، اگزاسيلين و نسل اول ، دوم و سوم سفالوسپورين ها و … بايد در فريزر نگهداري شوند ، و فقط مي توان مقداري از آن را بر اساس کار روزانه آزمايشگاه حداکثر به مدت يک هفته در يخچال نگهداري نمود . – بعضي آنتي بيوتيکهاي حساس مثل ايميپنم ، سفاکلر و ترکيبات کلاولانيک اسيد يا سولباکتام  اگر تا هنگام مصرف در فريزر نگهداري شوند ، پايداري بيشتري خواهند داشت . – ديسکها بايد در ظروف داراي درپوش محکم و حاوي مواد جاذب رطوبت نگهداري شوند . – ديسکهای آنتي بيوتيکي بايد يك تا دو ساعت قبل از استفاده از يخچال يا فريزر خارج شوند تا به درجه حرارت اتاق برسند .  
  دستورالعمل حفظ ونگهداری محیطهای کشت و دیسکهای آنتی بیوگرام بایستی توجه نمود که کلیه محیطهای کشت ساخته شده اعم از پلیتی یا لوله ای ، حداقل هفته ای یکبار و همچنین در هنگام استفاده ازنظر مشخصات ظاهری ، رطوبت مناسب، عدم وجود آلودگی، رنگ و ضخامت مناسب و تاریخ انقضاء مورد بررسی قرار گیرد.کلیه محیط های کشت درون یخچال4درجه سانتیگراد قرار می گیرند.محیط تایوگلیکولات استثناء بوده و بایستی در حرارت آزمایشگاه نگهداری شود.در مورد نگهداری سوشهای استاندارد نیز طبق دستورالعمل اقدام گردد.دیسکهای آنتی بیوگرام ذخیره در حرارت- 20   درجه و دیسکهای مصرفی در یخچال 2-8 درجه سانتی گراد نگهداری  v
                می شوند) . هنگام مصرف به حرارت اتاق رسیده سپس مورد استفاده قرار گیرند(                              معیارهای رد وقبول نمونه های بالینی ادرار:
نمونه ادرار بایستی تازه در آزمایشگاه گرفته شود.نمونه های گرفته شده در منزل در جای خنک گذاشته و ظرف کمتر از یک ساعت به آزمایشگاه تحویل داده شود .حجم نمونه ادرار بزرگسالان حداقل کمتر از 10 سی سی و در مورد نوزادان کمتر از 5 سی سی نباشد.(در موارد فوق بایستی به همکاران پذیرش اطلاع داد تا با بیمار تماس بگیرند و نمونه فوق تکرار شود)احتمال آلودگی باشد (باکتری اوری فراوان بدون داشتن WBC)قبل از انجام آزمایش ادرار از کرمهای واژینال استفاده نشود.از زمان نمونه گیری تا تحویل به آزمایشگاه بیشتر از یک ساعت نگذشته باشد.
        نمونه های تحویلی به آزمایشگاه بایستی کمتراز 2 ساعت انجام ونتیجه ثبت شود. Stool   نمونه های مدفوع نیز بایستی به صورت تازه در آزمایشگاه گرفته شود در غیر اینصورت کمتر از یک ساعت به آزمایشگاه تحویل داده شود .نمونه های تحویلی نیز بایستی در صورتی که فرم یا نرم باشد کمتر از 2 ساعت انجام شوند و در صورت آبکی بودن سریعاً کار شوند.نمونه بایستی از نظر حجم به حدی باشد که جهت انجام آزمایش مستقیم و روش رسوبی موجود درآزمایشگاه کافی باشد.نمونه قارچ فراوان نداشته باشد (تاریخ پذیرش و تحویل نمونه راچک کرده تا از زمان نمونه گیری مطمئن شویم) در صورت طولانی بودن این زمان ، نمونه بایستی تکرار گردد(مثلاً نمونه از شب قبل گرفته شده باشد)از پمادهای جلدی استفاده نشود.
نمونه گیری قارچ :
جهت نمونه گیری قارچی از پوست و مو بایستی محل فوق 48 تا72 ساعت آب نخورده و در این مدت از هیچ پماد و دارویی استفاده نشود. خون همکاران نمونه گیر جهت مقدار خون لازم برای آزمایشات مختلف دستورالعمل دارند، اما گاهی دیده می شود که پس ا زجداسازی سرم، نمونه سرم جهت آزمایشات بیمار کم است و یا اینکه گاهی ویال CBC لخته یا دارای رگه هایی از لخته است که بایستی نمونه فوق تکرار شود (با اطلاع به همکارارن پذیرش و ثبت در دفتر تماس) نمونه های همولیز نیز نیاز به نمونه گیری مجدد دارند.
تکرار نمونه و اطلاع رسانی :
در بخش میکروب شناسی هرگاه به علتی انجام یک آزمایش مقدور نباشد مثلاً مصداق موارد رد نمونه های بالینی باشد به همکاران بخش پذیرش اطلاع داده شده تا ضمن ثبت در دفتر پیگیری با بیمار تماس گرفته تا ضمن شرح علت تکرار آزمایش برای بیمار اقدام به نمونه گیری مجدد شود. در صورت عدم حضور مسئول فنی، با اطلاع به سوپروایزر این اقدام انجام شود.
   خصوصیات نمونه‌های مورد آزمایش:
نتیجه بسیاری از تستهای تشخیصی در بیماری‌های عفونی به نمونه مورد آزمایش، زمان انتخاب شده جهت نمونه برداری و روش نمونه برداری بستگی دارد.محافظت از نمونه  و ارسال آن باید به نحوی باشد که در طی این عملیات عامل بیماری از بین نرود. جدا نمودن یک عامل عفونی از نقاط استریل بدن از ارزش تشخیصی زیادی برخوردار می‌باشد. هر نوع میکروارگانیسمی که از خون، مایع نخاع، مایع مفصلی یا مایعی که از حفره جنب بدست آمده، مجزا گردد، یک یافته پرارزش تشخیصی قلمداد می‌شود.اصول کلی که در مورد تمام نمونه‌های بالینی صادق بوده و باید در هنگام اخذ نمونه به آنها توجه نمود به قرار زیر است. نمونه از لحاظ مقدار بایستی کافی بوده تا بتوان کلیه آزمایشات لازم را بر روی آنها انجام داد. نمونه بایستی از خصوصیت «معروف بودن» (Representative) برخوردار باشد (مثلاً اگر خلط بخواهد مورد آزمایش قرار گیرد، آب دهان به جای آن گرفته نشود.) باید توجه نمود که نمونه به نحوی گرفته شود که آلوده نگردد و جهت نمونه برداری بایستی از وسایل استریل استفاده نموده و شرایط آسپتیک رعایت شود. نمونه تهیه شده بایستی سریعاً به آزمایشگاه ارسال شود. نمونه‌های ارزشمندی بایستی قبل از آغاز درمان ضد میکروبی گرفته شوند و اگر بیمار قبلاً تحت درمان بوده باید در صورت امکان درمان را متوقف نموده و نمونه برداری چند روز پس از توقف درمان صورت گیرد.
جمع آوری نمونه جمع آوری مناسب یک نمونه جهت کشت بی‌شک مهمترین مرحله در اثبات وجود یک پروسة عفونی توسط یک میکروارگانیسم خاص می‌باشد. چنانچه درمان بر ضد ارگانیسم کومنسال یا آلوده کننده باشد، جمع آوری نامناسب نمونه نه تنها باعث عدم جداسازی میکروارگانیسم مربوطه می‌شود بلکه منجر به درمان نادرست و حتی مضر می‌شود..
در جمع آوری نمونه‌ها بایستی موارد زیر را در نظر داشت: نمونه باید ناحیه اصلی عفونت جمع آوری شده و حداقل آلودگی با ترشحات یا ارگانها یا بافتهای مجاور داشته باشد. زمان مناسب جهت جمع آوری نمونه بایستی مشخص گردد تا بدین ترتیب شانس جداسازی میکروارگانیسم‌ها به حداکثر رسد. مثلاً در تب تیفوئیدی میکروارگانیسم عامل عفونت را می‌توان در طی هفته اول بیماری از خون جدا نمود. کشت مدفوع و یا ادرار معمولاً در طی هفته دوم و سوم بیماری مثبت خواهد شد. آگلوتینین‌های سرمی در طی هفتة دوم شروع به افزایش کرده و در طی هفته پنجم به ماکزیمم مقدار خود می‌رسد. مقدار کافی از نمونه مورد نظر به منظور انجام تکنیک‌های کشت باید گرفته شود و دستورالعمل‌های لازم درمورد حجم مناسب نمونه مورد نظر جهت کشت باید تنظیم گردد. نمونه‌های ناکافی بایستی نگهداری شوند. چنانچه تهیه نمونه‌ای مجدد میسر نبود، و از نظر کلینیکی نیز کشت نمونه اندیکاسیون داشت بایستی روی نمونة اولیة ناکافی کارهای لازم انجام گیرد، با این وجود آزمایشگاه هنگام گزارش نتیجه باید شرایط نمونه دریافتی را برای پزشک گزارش نماید. به منظور اطمینان از جداسازی مطلوب میکروارگانیسم باید از لوازم نمونه گیری، ظروف و محیط‌های کشت مناسب استفاده نمود. ظروف نمونه گیری بایستی دارای درپوش محکم و مناسبی باشد که از نشت و آلودگی نمونه هنگام انتقال جلوگیری شود. سواب‌های پنبه ای ممکن است حاوی بقایای اسیدهای چرب باشد و سواب آلژینات کلسیم نیز ممکن است باعث نشر محصولات سمی شده و در نتیجه موجب ممانعت از رشد برخی از باکتریهای مشکل پسند گردد، لذا استفاده از سواب هائی از جنس داکرون یا پلی استر توصیه می‌شود. سواب‌های حاوی نمونه را باید در یک محیط انتقال دهنده یا ظرف مرطوب جهت جلوگیری از خشک شدن و مرگ باکتری قرار داد. حتی الامکان بایستی جمع آوری نمونه جهت کشت قبل از تجویز آنتی بیوتیک صورت گیرد. 
انتقال نمونه محیط‌های انتقال دهنده کری – بلیر،
. دریافت نمونه و مشاهدات اولیه در اکثر آزمایشگاههای تشخیص طبی محل مخصوصی جهت دریافت نمونه‌های کشت طراحی شده است. به علت احتمال آلودگی پرسنل آزمایشگاه با باکتریها و ویروسهای پاتوژن انتقال و مشاهدات اولیه بایستی زیر هود انجام گردد. ضروریست پرسنل با پوشیدن روپوش مخصوص و دستکش و در برخی موارد ماسک‌های جراحی از خود در برابر این عوامل بیماریزا محافظت نمایند
  کنترل کیفی محیط های کشت : پس از رسیدن درخواست خرید محیط های کشت و مواد مصرفی بخش میکروب  توسط مسئول انبار و کارشناس بخش میکروب کنترل کیفی و زنجیر سرد اقلام ورودی  بررسی شده و در صورت تایید مهر QC Pass درون فاکتور فروش زده می شود.  و همچنین همراه محیط های کشت تجاری و محصولات میکروب شناسی  فرم کنترل کیفی ارسال می شود که جهت بررسی مشخصات فیزیکی و همچنین از لحاظ آماده سازی و استریل نمودن می باشد و تحویل کارشناس بخش میکروب داده می شود. محیط های مورد استفاده جهت کشت STOOL 1.1.    محیط  XLD مواد انتخابی موجود در این محیط  :  املاح صفراوی  مواد افتراقی موجود در آن: لاکتوز- سو کروز- لیزین- گزیلوز  معرف این محیط :  فنل رد نتیجه کشت : باکتریهای لاکتوز مثبت کلنی های زرد رنگ و باکتریهای لاکتوز منفی کلنی های بی رنگ (مایل به قرمز) ایجاد می کنند. کنترل کیفیت: Ecoli         ATCC 25922           کلنی زرد تا زرد مایل به قرمز ایجاد می کند Streptococci  faecalis      ATCC 29212     
 رشد به طور جزئی مهار می شود Shigella  flexneri        ATCC 12022    
 روی محیط رشد کرده و کلنی قرمز ایجاد می کند Salmonella  Typhimurium         Atcc 14028  
روی محیط رشد کرده و کلنی قرمز با مرکز سیاه   SH 2= POS (   کنترل کیفیت : E.coli  ATCC 25922 محیط های مورد استفاده جهت کشت (Urine  ) 1.2. محیط sheep blood  Agar   : که با 5 %  خون گوسفندی تهیه می شود. کنترل کیفی:  
tapf. Areus      ATCC     25923 E.coli                                                                          ATCC      25922      ATCC  6305        Strep.pneumonied
رشد + همولیز آلفا    ATCC  19615      Strep. Pyogen     رشد + همولیز بتا
محیط (TSI  )« Triple Sugar Iron Agar» این محیط جهت بررسی تخمیر قندها و تولید گاز استفاده می شود که حاوی 1/0 %  گلوکز و 1 %سوکروز و 1%لاکتوز می باشد. تفسیر نتایج حاصله از کشت دادن روی این محیط که بوسیله آنس در عمق و سطح  اسلنت کشیده می شود بدین صورت می باشد اگر باکتری فقط گلوکز (که درصد کمتری دارد) را تخمیر کند و اسید تولید کند عمق محیط زرد رنگ شده و سطح بدون تخمیر می ماند  و به صورت ( Alkaline /Acid ) گزارش می شود. اگر باکتری از 2 تا از قندهای موجود استفاده کند اسید زیادی تولید کرده و در نتیجه کل لوله زرد رنگ شده و A/A  گزارش می شود. در مواردی مثل سودوموناس که هوازی اجباری است و در عمق از قندها استفاده نمی کند و در سطح هم از  روش اکسیداسیون از قند استفاده می کند رنگ محیط بدون تغییر باقی مانده و به صورت K/N.C  گزارش می شود. (NC: NO change  ) تولید گاز co2  ( بی رنگ ) و H2s  (سیاهرنگ ) در محیط به صورت وجود حباب ترک در محیط و یا پرتاب شدن از محیط به سمت بالای لوله مشاهده می شود.   وجود گاز را بدین صورت گزارش می دهیم:                                                                                                   A/A+H2 S           گاز کم           A/A                           گاز زیاد                      A/A  در صورت وجود H2s  در قسمت عمق محیط و مشخص نبودن رنگ محیط آن را A  در نظر می گیریم. K/A   + H2 H2s گاز عمق سطح ATC 25922 E.coli + A A K K ATCC 27853  Pseudomonas + + A K ATCC 14028 Salmonella Typhi A K ATCC 12022 Shigella Flex nary
کنترل کیفی:    
  نکته: جهت کن
ترل کیفی H2S  محیط میتوان از باکتریهای بی خطر تری مثل سیتروباکتر هم استفاده نمود.
«تست MR-VP» متیل رد: محیط دارای پپتون گلوکز و دی پتاسیم فسفات است اگر باکتری (E.coli ) بتواند از گلوکز محیط استفاده کند و محصولات اسیدی زیادی تولید کند. PH <4.5  می شود که در این حالت معرف متیل رد قرمز رنگ می شود و این شرایط اسیدی مانع از رشد مجدد باکتری شده و محیط اسیدی می ماند اما باکتریها ی MR-   (Entro bacter , klebsiella)در اثر تخمیر ضعیف قند الکل و استون تولید می کنند نه اسید. پس می توانند بیشتر رشد کرده و ازپپتون موجود در محیط استفاده کرد. و شرایط قلیائی ایجاد می کند که PH>6.5  می شود و متیل رد در این شرایط زرد رنگ است و تست منفی است. VP (وژ سپروکوئر): در صورتی که باکتری استیل متیل کاربینول تولید کند با معرفهای VP  واکنش داده و رنگ قرمز بعد از 15-10 دقیقه ایجاد می شود. تست منفی بدون تغیر رنگ است. به یک لوله حاوی  cc5  محیط MRVP 1 لوپ پر از باکتری اضافه کرده و به مدت 24-18 ساعت در انکوباتور قرار داده و سپس معرفها را اضافه می کنیم.
کنترل کیفی: E.coli   ATCC 25922                MR (+)      VP (-) Enterobacter aeroginosa   ATCC 13048    MR (-)      VP (+)      
طرز تهیه معرفهای محیط MR-VP  :
معرف متیل رد: پودر متیل رد    1/0 گرم اتانل 95 %  300 سی سی با آب مقطر به حجم 500 سی سی می رسانیم طریقه استفاده: به محیط MR  حدود 3-2 قطره از معرف را اضافه کرده و بهم بزنید و نتیجیه را قرائت کنید. معرف VP : α -نفتل 5 % در اتانل خالص KOH 40% طریقه استفاده: به محیط VP حدود 6-5 قطره از مصرف آلفانفتول اضافه
کرده و خوب مخلوط می کنیم و حدود 15-10 دقیقه در حرارت آزمایشگاه قرار بدهید سپس 3-2 قطره از محلول پتاس افزوده و خوب مخلوط نمائید پس از 5 دقیقه جواب را قرائت کنید. «محیطSIM» از این محیط بررسی سه ویژگی در باکتری مورد نظر استفاده می شود وجود یا عدم وجود SH2  تولید اندول و حرکت یا عدم حرکت باکتری. پودر محیط تجاری موجود است و محیط ساخته شده را در لوله ها تقسیم نموده و سپس اتو کلاو می شود پس از خنک شدن محیط به صورت نیمه جامد می باشد که امکان حرکت را برای باکتریها فراهم می کند. وجود تریپتو فان در این محیط عامل انجام تست اندول می باشد اگر باکتری از تریپتوفان استفاده کند اندول, اسید پیرو ویک و آمونیاک تولید می کند که اندول با معرف کواکس واکنش داده و رنگ قرمز ایجاد می کند که نشان دهنده مثبت بودن تست است.   کنترل کیفی: حرکت اندول SH2 .coli   ATCC  25922 + + + + Salmonella Typhi ATCC 3311 higella Flex nary ATCC 9199 «تست سیمون سیترات» محیط سیترات به صورت پودرهای آماده تجاری موجود می باشد با توجه به دستور ساخته شده اتو کلاو شده و سپس در لوله ها به صورت مورب ریخته می شود. رنگ محیط سبز رنگ می باشد اگر باکتری از سیترات سدیم موجود در محیط استفاده کند مواد قلیایی تولید کرده و معرف بروموتیمول بلو به رنگ آبی در می آید. کنترل کیفی:                                                                                                                                        رشد روی محیط +  تولید رنگ آبی    13048   Entero bacter aeroginosa  ATCC عدم رشد روی محیط-  رنگ محیط  بدون تغیر   E.coli  ATCC 25922 نکته: هنگام تلقیع به محیط ستیرات باید یک نکته مهم را در نظر بگیریم در هنگام تلقیع باکتری به یکسری محیط تشخیصی بعد از فلامبه (سوزاندن) کردن آنس و سرد نمودن آن اولین محیط سیمون سیترات باشد . چنانچه محیط سیمون سیترات قرار است در بین محیط های دیگر تلقیع واقع شود باید حتما قبل از تلقیع آنس مجددا سوزانده و سرد شود تا از انتقال ذرات یک محیط دیگر به محیط سیترات پیشگری بعمل آید تا از پاسخ مثبت کاذب جلوگیری شود. «تست اوره آز» جهت انجام این تست از محیط های آماده تجاری اوره استفاده می شود که محیط پایه را حرارت تا حل شده اتو کلاو می کنیم . به آن با توجه به دستور ساخت روی محیط مقدار کافی تعیین شده از اوره 40% را اضافه می کنیم. محیط را در لوله های اتو کلاو شده ریخته و به صورت مورب جهت تهیه اسلنت قرار می دهیم. محیط زرد رنگ است اگر باکتری آنزیم اوره آز داشته باشد اوره را هیرولیز کرده آمونیاک تولید کرده محیط قلیائی شده و معرف فنل رد به رنگ صورتی مایل به ارغوانی در می آید.     کنترل کیفی: صورتی تند- قرمز-ارغوانی  proteus   vulgaris   ATCC  8427                                   زرد رنگ ( محیط بدون تغیر می ماند) E.coli   ATCC   25922                                                                   Lysine Iron Agar»»   این محیط حاوی قند و اسید آمینه است. باکتری ابتدا از قند موجود در محیط استفاده کرده PH  محیط کمتر از 5.2 خواهد شد و معرف بروموکزرول پرپل به رنگ زرد در می آید. در شرایط اسیدی اگر باکتری آنزیم های دکربوکسیلاز را داشته باشد آنزیم ها فعال شده وCOOH  را coo¯   تبدیل کرده و در نتیجه PH  > 6.8  شده و محیط به رنگ بنفش تیره در می آید که نشانگر مثبت بودن تست است. اگر باکتری قادر به آمینه کردن لیزین باشد باعث گسترش رنگ قرمز در سطح برروی عمق اسیدی می شوند. سیترات آمونیوم فریک و تیو سولفات سدیم معرف های تشکیل SH2  اند که با سیلهائی که SH2  تولید می کنند به علت تولید سولفید فروز باعث سیاه شدن محیط می شوند.  کنترل کیفی: SH2 عمق سطح SALMONELLA- Arizona ATCC 13314 + ارغوانی بنفش ارغوانی- بنفش + زرد ارغوانی- بنفش Citrobacter freundii ATCC  8454 زرد قرمز Proteus Vulgaris ATCC 9484   «بایل اسکولین آگار» باکتریها (استرپهای گروه D ) در این محیط گلیکوزید اسکولین را به اسکولتین و دکستروز تجزیه می کنند. اسکولتین با نمک آهن موجود در محیط کمپلکس قهوه ای- سیاه ایجاد می شود. محیط را با 3-2 کلنی تلقیع کرده و پس از 24-18 ساعت انکو باسیون بررسی می کنیم. انتروکوکها و استرپهای گروه D  قادر به رشد هستند و سایر استرپها توانائی رشد ندارند.   کنترل کیفی: رشد به روی محیط و ایجاد رنگ سیاه در آن     Enterococus  Faecalis   ATCC  29212                                                    »محیط «SFM این محیط که جهت شناسائی انتروکوک ها استفاده می شود. محیط Nacl 6.5 %  است که دارای معرف بروموکزول پرپل می باشد رنگ محیط بنفش تا ارغوانی تیره است اگر باکتری مورد نظر انتروکوک باشد معرف به رنگ زرد تغییر می یابد و در غیر این صورت به همان رنگ باقی می ماند. این تست همراه تست (بایل اسکولین) استفاده شده است. نکته: به جای محیط SFM  میتوانید از محیط TSB  حاوی 6.5%  NaCl استفاده کنید که پس از 24-18 ساعت انکوباسیون در 37 درجه سانتیگراد محیط تلقیع شده چنانچه دارای کدورت باشد نشانه رشد باکتری در این شرایط است و نتیجه تست مثبت خواهد بود در غیر این صورت (عدم کدورت) نتیجه منفی است.     SFM B.E  هیدرولیز + + + کنترل کیفی:  (Enterococus  Faeculis  )        (Strep.Group D-non Entrococci )       (Strep. Viridans )     »تست اکسیداز» معرف این تست: تترامتیل پارافنیل دی آمین دی هیدروکلراید است. 1 گرم از پودر معرف را با آب مقطر به حجم  ml 100رسانیده سپس آن را در ویالهایcc 1-5/1 تقسیم کرده و تا قبل از مصرف در فریزر نگهداری می کنیم. در هنگام مصرف پس از ذوب شدن معرف ,کاغذ صافی را به معرف آغشته کرده و سپس با سواپ بی پنبه (اپلیکاتور پلاستیکی) مقداری از کلنی را روی کاغذ حاوی معرف بمالید. چند ثانیه ای صبر کرده اگر باکتری آنزیم سیتوکروم اکسیداز داشته باشد با این سوبسترا واکنش داده و ایجاد رنگ بنفش نشان مثبت بودن تست است. دیسکهای تجاری اکسیداز نیز در دسترس می باشد. که تغییر رنگ دیسک به رنگهای تیره نشان دهنده ی مثبت بودن تست می باشد. نکته: جهت برداشت باکتری و قرار دادن آن روی دیسک اکسیداز هرگز از آنس یا لوپ فلزی استفاده نکنید چون احتمال ایجاد مثبت کاذب وجود داردو همیشه از اپلیکاتور پلاستیکی جهت این کار استفاده کنید.   «تست ONPG» «اورتو نیترو فنل بتادی گالاکتو زیداز« در لوله های آزمایش 3 سی سی سرم فیزیولوژی ریخته و دیسکهای تجاری ONPG  را درون لوله ها می اندازیم و اتوکلاو میکنیم که دیسکها در ته لوله ها قرار گیرند باکتری مشکوک را به این محیط تلقیع می نماییم  و 24 ساعت آن را انکوبه می کنیم اگر باکتری آنزیم بتا گالاکتوزیداز داشته باشد ONPG  را به گالاکتوز و اورتونیتروفنل تبدیل می کند که اورتو در محیط کشت ایجاد رنگ زرد کرده و نشان دهنده مثبت بودن تست است. «تست حلالیت در صفرا« در یک لوله حاوی 500 لاندا سرم فیزولوژی سوسپانسیونی از استرپ مورد نظر تهیه کرده و کدورت آن را با 0.5 مک فارلند می سنجیم. سو سپانسیون تهیه شده را به مقادیر مساوی بین دو لوله آزمایش تقسیم می کنیم.(250 لاندا ) به یکی از لوله ها 250 لاندا سرم فیزیولوژی و به لوله دیگر 250 لاندا سدیم داکسی کولات 2% اضافه کرده و به آرامی مخلوط کنید. لوله ها را به مدت 2 ساعت در حرارت 35-37 درجه قرار داده و به طور متناوب جهت بررسی لیز سلولی ( که باید در لوله های حاوی صفرا ظاهر شود)چک کنید. شفاف شدن لوله یا به عبارتی از بین رفتن کدورت تشخیص را مسجل می کند. «تست تعیین حساسیت به اپتوچین» اپتوچین (اتیل هیدرو کوپرئین هیدروکلراید) یک رنگ است. بر روی محیط بلاد آگار کشت متراکم داده و سپس در وسط آن دیسک را گذاشته و پلیت را در جار بی هوازی یا 10% co2 می گذاریم پس از 24-18 ساعت انکوباسیون هاله اطراف دیسک را اندازه گرفته.   Zone >14 mm    دیسک 5 میلی گرمی   Zone > 16 mm دیسک 10 میلی گرمی   9 mm >Zone >13 mmباید تحت آزمایش حلالیت صفرا قرار گیرند نمونه حساس به اپتوچین استرپتوکوک پنومونیه است. نمونه ای با منطقه 9> Zone>13 mm می تواند انتروکوک یا استرپهای ویریدانس باشد. »تست تعیین حساسیت باسیتراسین» بوسیله لوپ 3 با 4 کلونی از استرپ برداشته و به طور غلیظ در قسمت فوقانی پلیت کشت چمنی (یکدست) داده و سپس دیسک باسیتراسین 04/0 واحدی را گذاشته و به مدت 24 ساعت در انکوباتور قرار می دهیم . ایجاد هاله اطراف دیسک نشاندهنده حساسیت باکتری به این تست می باشد. نتیجه: استرپتوکوکهای گروه A  به باسیتراسین حساسیت نشان می دهند. «تست CAMP  استرپی» استرپهای بتا همولتیک مولد بتا همولیزی اند که با بتا توکسین استافیلوکوک اورئوس به طور مشترک عمل می کند. برای مشاهده این پدیده در محیط Sheep blood Agar  استرپ را به صورت خط عمود بر استاف تلقیع می کنیم در نتیجه تولید همولیز پیکانی شکلی در محل تلاقی دو خط کشت چنانچه تست کمپ مثبت باشد ایجاد می نمایند. «تست کواگولاز» کواگولاز آنزیمی است که با پروتروبین سرم ترکیب شده و فیبرینیوژن را به فیبرین (لخته) تبدیل می کند. پودر پلاسمای آماده تجاری را به نسبت 1 به 5 با آب مقطر مخلوط کرده و پس از انحلال کامل پلاسما را در لوله های نو و در هر لوله 500 لاندا تقسیم کرده و در فریزی منهای 20 درجه نگهداری می کنیم. جهت استفاده: 100 لاندا (0.1 سی سی) از آبگوشت تازه باکتری را به هر لوله اضافه کرده و به مدت 4-1 ساعت در انکوباتور 37 درجه نگهه می داریم و نتیجه را از نظر ایجاد لخته چک می کنیم. توجه بشود که چک بعد از 24 hr ممکن است نتیجه منفی کاذب را نشان دهد و لخته حل شده باشد. نکته: چنانچه از پلاسمای تازه تهیه شده جهت این تست استفاده می نمایید آن را به نسبت 2/1 با سالین رقیق کنید(نمک موجب رشد سریعتر استافیلوکوک می شود) نکته:چنانچه پس از 24 ساعت تست را بررسی می کنید پس از اینکه لوله کوآگولاز را از محیط 37 درجه خارج کردید نتیجه را خوانده و لوله را در محیط آزمایشگاه قرار دهید و مجددا پس از 3-2 ساعت لوله را از نظر وجود لخته قرائت کنید اگر لخته مجددا تشکیل شده باشد نتیجه تست مثبت می باشد.        ” کنترل کیفیت محیط مولر “ برای کنترل کیفی محیط مولر می توان از دیسک SXT همراه با سوش انتروکوک فکالیس ATCC 29212 استفاده کرد.در ضمن PH محیط باید مناسب با نوع باکتری باشد .
پس از تهیه سوسپانسیون ۵/ مک فارلند از کلونی انترکوک و کشت بر روی محیط مولر یک دیسک SXTگذاشته و نتیجه را پس از ۲۴-۴۸ ساعت بعد بررسی کرده در صورتی که هاله عدم رشد بیشتر یا مساوی با ۲۰ میلی متر ایجاد کرد نتیجه می گیریم که محیط مولر از کیفیت خوبی برخوردار است در غیر این صورت باید در پی رفع عیب باشیم. « محیط سلنیت F»  (Selenite enrichment broth) F محیط سلنیت 
محیط سلنیت  Fاز محیط های غنی کننده – انتخابی است. محیط زرد کم رنگ بوده  و نیاز به اتوکلاو ندارد. محیط مغذی است برای جدا سازی گونه های سالمونلاها .که یک محیط غنی کننده Enrichment می باشد که حاوی سلنیت سدیم است که یک نمک صفراوی است و مانع از رشد باکتری های گرم مثبت و بسیاری از باکتری های گرم منفی می گردد. میزان تکثیر سالمونلا در این محیط طی ۹-۶ ساعت اول از رشد هر یک از باکتری های روده ای سریعتر است. بنابر این کشت ثانوی باکتری در محیط های دیگر باید ظرف همان روز (۹-۶ ساعت) انجام گردد. طرز تهیه محیط  سلنیت F:
– ابتدا 100 سی سی  آب مقطر در داخل یك ارلن ریخته سپس 3/2 گرم  پودر سدیم سلنیت براث را به آن اضافه و حل نمائید .
– محتویات ارلن را روی شعله حرارت دهید تا گرم شود و محیط شفاف شود ولی نجوشد.
– سپس محیط را در لوله های شیشه ای ترجیحا استریل به میزان 3 سی سی در هر لوله توزیع می کنیم و روی هر لوله پنبه زده می شود و بعد از خنک شدن محیط ها را به یخچال 8-2 درجه انتقال می دهیم.

»محیط شکلات آگار» از این محیط در آزمایشگاه جهت تهیه ساب کالچر از کشت های خون و کشتهای مجاری خلط و .. استفاده می شود. برای ساخت خون گوسفندرا هنگامی که محیط پایه گرم و داغ (حدود 80 ) درجه است اضافه می کنیم تا هموگلوبین و نیکوتین آمید ادنین دی نوکلئوتیدهای موجود در سلول های قرمز آزاد شود که در این فاکتورها برای رشد هموفیلوس و نیسریاها مورد نیاز است.           نتیجه: رشد با همولیز آلفا                                             Streptococci  pneumoniea    ATCC 6305             نتیجه:رشد روی محیط                                                                 Hemofilus  Infloanza     ATCC   10211   کنترل کیفیت محیط های کشت میکروبی کنترل کیفی محیط های کشت میکروبی: اصطلاحات مربوط به سویه های میکروبی کنترل سویه کنترل (Control Strain): میکروارگانیسمی که برای ارزیابی عملکرد میکروبی محیط کشت استفاده می شود. سویه مرجع (Reference Strain): میکروارگانیسمی که حداقل تا سطح جنس و گونه شناسایی شده و بر اساس ویژگی ها و ترجیحاً منشا آن، فهرست بندی و تعریف شده است. ذخیره های مرجع (Reference Stocks): کشت های بدست آمده از پاساژ سویه مرجعی که از مراکز بین المللی تهیه شده است. ذخیره های کاری (Working Stocks): کشت مجددی که از کشت های ذخیره جهت کنترل کیفیت محیط های کشت استفاده می شود.  منبع سویه های کنترل: همه سویه های کنترل که در جدول ۲ از آنها نام برده شده است، ATCC  می باشند . .(American type culture collection) این سوشها، حداقل سوشهایی هستند که باید برای ارزیابی هر محیط کشت استفاده شوند. ارگانیسم های مورد استفاده برای اهداف کنترل کیفی می تواند از سویه های National collection باشد. سویه های دیگری نیز ممکن است توسط سازنده محیط کشت به کار رود که شامل مجموعه ای از سویه های وحشی (Wild strain) یا بدست آمده از نمونه های بیمار می باشد که مختص هر آزمایشگاه بوده و برای انجام آزمایش های بیشتر به کار می روند.  روش انجام آزمون کنترل کیفیت محیط های کشت تهیه سوسپانسیون میکروبی: یک کشت از ارگانیسم کنترل کیفی روی پلیت بلادآگار تهیه کنید. بعد از انکوباسیون پلیت ۵-۳ کلنی ایزوله را در مقدار کمی تریپتیکیس سوی براث (TSB) استریل حل نمایید تا سوسپانسیون میکروبی حاصل شود و آن را برای چهار یا پنج ساعت انکوبه نمایید. سپس کدورت آن را با استاندارد نیم مک فارلند تنظیم کنید. (استاندارد نیم مک فارلند در طول موج ۶۲۵ nm، دارای جذب ۰۸/۰ تا ۱/۰ ناتومتر می باشد. (به جای این روش می توان مستقیماً از کلنی های ایزوله روی پلیت، سوسپانسیون میکروبی مطابق با کدورت نیم مک فارلند تهیه کرد. بدین ترتیب که ۵-۳ کلنی ایزوله روی پلیت ۲۴ ساعته را در ۵-۳ میلی لیتر سرم فیزیولوژی استریل حل کرده و کدورت آن را با نیم مک فارلند تنظیم نمایید. با هر روشی که این سوسپانسیون میکروبی تهیه شود، باید کدورتی حاوی ۱۰۷-۱۰۸ CFU/ml کلنی داشته باشد. (مطابق با استاندارد نیم مک فارلند).    بررسی آزمایش های عملکردی محیط کشت (Performance testing) ۱- آزمایش ظرفیت مغذی بودن (Nutritional activity) محیط  های کشت پلیتی مانند بلاد آگار سوسپانسیون اولیه را به نسبت ۱ به ۱۰۰ در نرمال سالین یا آب مقطر استریل رقیق نموده و مقدار lµ ۱۰ یا ml 01/0 سوسپانسیون رقیق شده را به محیط کشت مورد آزمایش تلقیح کنید. تعداد کلنی های مورد انتظار در هر پلیت (CFU/plate) 104-103 می باشد. برای اجتناب از رشد زیاد باکتری در بعضی از محیطهای کشت انتخابی ممکن است نیاز باشد که سوسپانسیون را ده بار رقیق تر تهیه نمایید.   ۲- آزمایش ظرفیت مهار کنندگی محیط های کشت انتخابی پلیتی مانند مکانکی آگار سوسپانسیون اولیه را به نسبت ۱ به ۱۰ در نرمال سالین یا آب مقطر استریل رقیق نموده و مقدار lµ ۱۰ یا       ml01/0 سوسپانسیون رقیق شده را به محیط کشت مورد آزمایش تلقیح  کنید. تعداد کلنی های مورد انتظار در هر پلیت (CFU/plate) 105-104 می باشد. برای اجتناب از رشد زیاد باکتری در بعضی از محیطهای کشت انتخابی ممکن است نیاز باشد که سوسپانسیون ده بار رقیق تر تهیه شود.   ۳- آزمایش محیط های کشت لوله ای هر لوله باید با lµ ۱۰ یا 01/0 ml از سوسپانسیون اولیه تهیه شده مطابق با نیم مک فارلند (بدون رقیق سازی) تلقیح شود. گاهی ممکن است به تلقیح کمتر یا بیشتر نیاز باشد.  محیط مورد آزمون را بعد از تلقیح تحت شرایطی که در جدول ۲ آمده است، انکوبه نمایید. به طور نرمال  زمان انکوباسیون، ۲۴-۱۸ ساعت یا ۴۸-۲۴ ساعت در دمای Cº ۲±۳۵ می باشد. محیط شکلات آگار و سایر محیط های کشت برای جداسازی انتخابی گونه های نیسریای بیماریزا باید در ۱۰- ۵% Co2 انکوبه شوند و در فواصل زمانی۲۴-۱۸ ساعت وسپس ۴۸-۲۴ ساعت بررسی گردند. برای باکتری های بی هوازی، کشتها عموماً به حداقل ۴۸ ساعت انکوباسیون در شرایط بی هوازی و غنی از Co2 نیاز دارند. در مورد کمپیلوباکتر آگار، پلیتها باید در Cº ۴۲ در شرایط میکروآئروفیلیک غنی از Co2 به مدت ۴۸ ساعت انکوبه شوند.  ۴- کنترل محیط های کشت برای آزمایشهای بیوشیمیایی از سوسپانسیون میکروبی رقیق نشده برای کنترل این محیطها استفاده می کنیم. پس از تلقیح، تمام کشت ها را در شرایط لازم (از نظر Co2، رطوبت و یا شرایط بیهوازی و درجه حرارت مناسب) قرار داده و پس از طی مدت زمان لازم (۲۴ تا ۴۸ ساعت) آنها را مورد بررسی قرار می دهیم. محیط های مناسب دارای رشد کافی از کلنی های باکتریهای مورد نظر می باشند و در مورد محیطهای انتخابی مهار میکروارگانیسمهای مورد نظر باید مشخص باشد. کنترل محیط های ساخته شده تجاری (آماده مصرف): رطوبت: محیطهای کشت باید بدون هر گونه رطوبت اضافی بوده، همچنین هیچ نشانه ای از خشک شدن اطراف محیط کشت نباید مشاهده گردد. سترون بودن: محیطهای کشت باید عاری ازآلودگی باشند. رنگ: محیطهای کشت آگار خوندار نباید هیچ نشانه ای از همولیز داشته باشند و محیطهای کشت دیگر نباید هیچگونه تغییر رنگ           غیر طبیعی داشته باشند.   بررسی آلودگی محیط های کشت (استریل بودن محیط های کشت): در صورتیکه تعداد پلیت یا لوله تهیه شده در هر سری ساخت یا Lot، ۱۰۰ عدد یا کمتر باشد، باید به تعداد ۵-۳% محیط های تهیه شده را در دمای Cº ۳۷-۳۵ به مدت ۵-۲ روز انکوبه نمود. برای Lot های با تعداد بیش از ۱۰۰، باید به تعداد ۱۰ پلیت یا لوله را به طور تصادفی برداشته و در شرایط فوق انکوبه نمود. بعد از انکوباسیون هیچ گونه رشد میکروبی نباید مشاهده شود.   تفسیر نتایج: یک محیط کشت زمانی قابل قبول می باشد که با همه سویه های پیشنهادی برای آزمون محیط کشت که در جدول ۲ مشخص شده است، رشد کافی داشته و خصوصیات مورفولوژیکی کلنی ها بارز باشد. در مورد محیط های انتخابی، رشد بعضی از ارگانیسم های خاص مهار می شود، ضمن اینکه اجازه رشد کافی به سایرارگانیسم می دهد. در بعضی موارد، واکنشهای رنگی خاص یا همولیز همچنانکه در جدول ۲ آمده است، باید ایجاد شود. مثلاً در مورد کشت بلادآگار ایجاد همولیز مناسب ضروری است و یا برای محیط مکانکی آگار ایجاد واکنش های رنگی برای سویه های میکروبی مشخص ضروری می باشد.  سایر معیارهای تضمین کیفیت: محیطهای کشت آماده مصرف باید از نظرموارد زیر نیز بررسی شوند: شکستگی ظروف پتری پر شدن ناصاف پلیتها ترک خوردگی محیط کشت در پلیتها وجود همولیز (برای بلاد آگار) یخ زدگی وجود مقدار زیاد حباب یا حفره در سطح محیط کشت نکته : معرف ها در هر سری ساخت و سپس سه ماه یکبار و در موارد خاص در هر روز کاری برای واکنش های مثبت و منفی کنترل کیفی می شوند. نکته : آنتی سرم ها در هر سری ساخت و سپس شش ماه یکبار برای شدت واکنش های مثبت و واکنش منفی کنترل کیفی می شوند . نکته : دیسک ها تشخیصی ( ONPG / اپتوچین / باسیتراسین / نووبیوسین / اکسیداز ) در هر سری ساخت و سپس ماهی یکبار برای واکنش های مثبت و منفی کنترل کیفی می شوند و نتایج آن ثبت می شود. نکته : تمامی معرف ها ، آنتی سرم ها و دیسک های تشخیصی طبق دستورالعمل شرکت سازنده نگهداری می شوند.    نحوه تفسیر نتایج کشت خون محیط های کشت خون ( حاوی ماده ضد انعقاد SPS ) مورد استفاده در آزمایشگاه به شکل آماده وتجاری بوده وبه دو شکل قابل استفاده برای اطفال و بزرگسالان می باشد. جهت اطفال 3 سی سی و بزرگسالان 5 سی سی خون مورد نیازاست .خون گرفته شده را پس از تعویض سرسوزن در کنار شعله و پس از استریل کردن درب محیط کشت به آرامی و قطره قطره از دیواره کناری ظرف کشت خون وارد ظرف کرده ،در انتها شیشه را به آرامی تکان داده درون 37 درجه قرار میدهیم. درج تاریخ خونگیری همراه با نام و شماره بیمار روی لیبل شیشه الزامی است . پس از گذشت 3 روز ابتدا به بررسی ظاهری محیط پرداخته و شفافیت و یا کدورت آن را بررسی کرده سپس با استفاده از سرنگ از محلول رویی کشیده و علاوه بر Sub culture روی محیط بلادآگار و شکلات آگار یک نمونه گسترش تهیه و رنگ آمیزی گرم می نمائیم. این کار در پایان هفته اول ، دوم و سوم باید انجام شود.در صورت مثبت بودن نتیجه کشت پس از تهیه گسترس و رنگ آمیزی گرم طبق دستورالعمل های کشتهای باکتری گرم منفی و یا مثبت اقدام می شود.در نهایت جهت تائید قطعی می توان از آنتی سرم های موجود نیز استفاده نمود.(نمونه های مشکوک به بروسلولز بایستی تا 4 هفته نگهداری شوند.) توجه : حجم محیط کشت کودکان حدود  ml 30 و بزرگسالان حدود ml  50  است . نسبت حجم خون به حجم محیط کشت خون در مورد کودکان باید 1:10 تا 1:20 باشد ، یعنی مقدار ml  3-1 خون به ازای ml 20 محیط کشت خون و در مورد بزرگسالان نسبت باید 1:5 تا 1:10 باشد ، یعنی ml 10-5 خون به ازای ml 50 محیط کشت خون. نکته : در صورت مثبت شدن نتیجه اولیه کشت خون سریعا به پزشک و یا سایر کادر درمان اطلاع داده می شود. محیط های کشت خون باید طی انکوباسیون در روز اول ، دو بار و سپس بطور روزانه از نظر وجود علائم رشد میکروارگانیسم ها نظیر همولیز ، لخته ، کدورت ، تولید گاز و وجود کلنی بررسی گردند. نکته : از محیط های کشت خون باید رنگ آمیزی گرم و یا ساب کالچر بر روی محیط شکلات آگار در فاصله زمانی 12 تا 48 ساعت اولیه انجام شده و نتایج آنها ثبت گردد. لازم بذکر است که پلیت شکلات آگار باید در اتمسفر  CO2 انکوبه شود و به مدت 5 روز از نظر وجود رشد بررسی گردد. نکته : کشت های خون در موارد مشکوک به بروسلوز یا عفونت های سخت رشد و عفونت های قارچی حداقل به مدت 4 هفته انکوبه و بررسی می شوند. در صورت مثبت شدن کشت های خون مثبت اولیه به پزشک یا سایر کادر درمانی اطلاع رسانی می شود و با آن مثل موارد بحرانی برخورد می شود . در مورد بیماران سرپایی نیز به خود بیمار یا همراهش تماس گرفته می شود. نکته : میزان آلودگی نمونه های کشت خون مثبت در فواصل زمانی 6 ماهه بررسی می شود بدین صورت که میزان آلودگی 3% یا کمتر (تعیین میزان آلودگی باید با هماهنگی پزشک معلج و پرستار یا پزشک کنترل عفونت انجام شود)/ میزان آلودگی 3-6 % / در صورتی که فقط احتمال آلودگی بررسی می شود یا میزان آلودگی بیش از 6 % باشد. ) نحوه انجام و تفسیر نتایج کشت مدفوع نمونه گرفته شده را باید سریعاً کشت نمود برای این کار ابتدا نمونه را با سواپ استریل روی محیط مکانکی و SF برده پس از گذشت 24 ساعت ازنمونه SF روی محیط های XLD  یا SS و مکانکی میبریم محیط SF به عنوان یک محیط مغذی بوده که به نمونه های پاتوژن نظیر سالمونلا و شیگلا امکان رشد بیشتری می دهد. استفاده از محیط های مکانکی در روز اول به این دلیل است که اگر پس از گذشت 24 ساعت تشخیص نمونه های فوق قطعی شد سریعتر جواب بیمار داده شده در غیر اینصورت در روز دوم روی نتایج به دست آمده به شرح زیر بررسی می شود.نمونه های پاتوژن معمولاً لاکتوز منفی هستند که جهت تشخیص قطعی آنها بایستی از محیطهای افتراقی Imvic استفاده شود جهت انجام و تفسیر نتایج تستهای افتراقی از دستورالعمل های مربوطه موجود در بخش میکروب شناسی استفاده می شود.ضمناً جهت تشخیص قطعی نمونه های پاتوژن E.coli و سالمونلا و شیگلا از آنتی سرم های موجود در آزمایشگاه که مربوط به شرکت بهارافشان بوده استفاده می شود. نحوه استفاده از این آنتی سرمها در بروشور کیتهای مربوطه موجود می باشد. نکته : استفاده از آگار خوندار برای مشاهده همولیز و انجام تست اکسیداز در نمونه های اسهالی مشکوک به ویبریو و آئروموناس توصیه می شود.   نحوه تفسیر نتایج کشت ادرار پس از گذشت 24 ساعت از انکوباسیون پلیتهای کشت داده شده آنه را از اتوکلاو خارج کرده به بررسی پلیتها می پردازیم ، اگر در هر دو پلیت EMB و بلادآگار هیچ کلنی رشد نیافته بود نتیجه کشت No growth گزارش می شود .هنگام گزارش نتایج کشت بایستی به میزان WBC و مقدار باکتری اوری گزارش شده همزمان توجه نمود ، اگر نمونه ای که No growth بوده ولی باکتری اوری همراه با WBC داشته ممکن است بیمار قبل از دادن نمونه ادراردر حال مصرف آنتی بیوتیک بوده و یا اینکه لوپ را زمانی که خیلی داغ بوده درون ادرار کرده که در هر دو این موارد بایستی نمونه آزمایش تکرار شود.در تماس با بیمار بایستی از مصرف یا عدم مصرف آنتی بیوتیک آگاه شد ، در صورت مصرف آنتی بیوتیک و اصرار به انجام آزمایش ادرار بایستی مصرف دارو حداقل 3 روز قطع شود. ( برای کشت تمامی نمونه ها از جمله کشت ادرار از یک  پلیت جداگانه برای هر بیمار استفاده شود ) درصورتی که باکتری رشد کرده بود به بررسی پلیت ها می پردازیم اگر باکتری رشد یافته روی هر دو پلیت EMB و بلادآگار بود گرم منفی و اگر تنها روی بلاآگار بود گرم مثبت می باشد، اما برای اطمینان از این مسئله ابتدا به تهیه لام اقدام  کرده رنگ آمیزی گرم می نمائیم ، برای این کار روی یک لام تمیز یک قطره سرم فیزیولوژی استریل ریخته با نوک یک آنس ،یک کلنی را برداشته در سرم فیزیولوژی روی لام حل کرده و آن را پهن کرده تا نازکتر شده و می گذاریم تا خشک شود.سپس چندین دفعه لام را روی شعله گرفته و خارج کرده تا گسترش تهیه شده روی لام فیکس شود پس از خنک شدن طبق دستورالعمل رنگ آمیزی گرم (صفحه    ) لام را رنگ کرده پس از خشک شدن عدسی میکروسکوپ به بررسی آن می پردازیم ، لازم به یادآوری است که کلنی کانت کمتر از 10³ به عنوان آلودگی محسوب شده در همین جا  باید یادآور شد که اگر نمونه ا درار مربوط به نوزاد باشد و شرایط جمع آوری نمونه کاملاً بهداشتی و طبق دستورالعمل باشد وجود حتی چند کلنی هم اهمیت کار کردن دارد. کلی کانت بین 10³تا 10⁵ گویای مشکوک بودن نمونه به عفونت بوده و کلی کلنی کانت بیش از 10⁶ هم یک عفونت قطعی را بیان می کند. در شرایطی که باکتری رشد یافته مربوط به یک کاتتر آلوده بوده و یا در نمونه هایی که E.Coli رشد می کند  تعداد کلنی های 10²تا10³ نیز قابل توجه هستند.اگرباکتری رشد یافته گرم مثبت بود ابتدا برا ی آن طبق دستورالعمل تست کاتالاز انجام می دهیم، اگر مثبت بود استاف بودن تائید می شود.حال باید اثبات نمود که این نمونه کدام یک از انواع استافیلوککها می باشدکه برای  این کار طبق دستورالعمل تست کواگولاز انجام داده اگر مثبت بود برای تائید می توان روی محیط مانیتول برده 24 ساعت در انکوباتور انکوبه کرد اگر رشد کردو محیط به رنگ زرد تغییر رنگ داد نتیجه مثبت بوده و نمونه رشد یافته استافیلوکک کواگولاز مثبت یا استاف اوئورس می باشد.حال اگر تست کواگولاز منفی بود برای تشخیص نهایی از کلنی فوق روی نصف یک محیط بلادآگار برده و دیسک 5 میکروگرمی نووبیوسین را روی آن قرارداده24 ساعت درون انکوباتور گذاشته وسپس به بررسی قطرهاله عدم رشد میپردازیم .اگر قطرهاله ای دیده نشد و یا کمتر از 12mm بود جواب منفی تلقی شده ، باکتری فوق استاف ساپروفیتیکوس می باشد اما اگر قطر هاله از 12mm بیشتر بود نمونه فوق استاف اپیدرمیدیس می باشد. اگر نمونه کاتالاز منفی بود، Stoph نبوده و استرپتوکک می باشد که بررسی لام رنگ آمیزی شده این مسئله را تائید میکند. از نمونه فوق طبق دستورالعمل شیرابه ای مطابق نیم مک فارلند تهیه کرده روی محیط بلادیا مولرهینتون برده دیسک اپتوچین و با  سیتراتین 4% واحدو دیسک SXT روی آن گذاشته درون اتو 37 درجه سانتی گراد گذاشته پس از 24 ساعت به بررسی قطر هاله عدم رشد می پردازیم . اگر قطر هاله عدم رشد اپتوچین بیش از 10 میلی متر بود پنوموکک تائید می گردد. استرپتوکک  بتا همولتیک گروه A به باسیتراسین حساس و به SXT مقاوم می باشد. استرپتوکک بتاهمولتیک  گروه B به هر دو آنتی بیوتیک با سیتراسین وSXT مقاوم می باشد. اما اگر نمونه فوق روی هردو پلیت مکانکی آگار و بلادآگار رشد کرده بود با تهیه لام و رنگ آمیزی گرم ، گرم منفی بودن آن تائید شده پس از کانت کردن کلنی ها اقدام به تشخیص نمونه رشد یافته میکنیم .برای این کار بایستی از آزمایشات افتراقی Imvic و دیگر تستهای تشخیص استفاده نمود، برای یکایک این آزمایشات دستورالعمل جداگانه ای وجود دارد که بایستی در هر مرحله طبق آن عمل کرده ، سپس از ثبت نتایج با استفاده یک جدول تشخیص معتبر به تعیین نام باکتری اقدام نمود.   کشت CSF  و سایر مایعات استریل بدن نوع نمونه : مايع مغزي نخاعي لوازم مورد نیاز :
محیط کشت CA,BA,Tio,MC ( جهت اطلاع )
 انكوباتور 37 درجه سانتيگراد
 جار
سانتريفوژ
رنگ گرم
لام شيشه اي اساس آزمایش :
روش انجام آزمایش :
آزمايش مستقيم:
الف) بررسي ماكروسكوپي: مايع نخاع طبيعي شفاف و بيرنگ بوده و ميزان چسبندگي آن مانند آب است.
ب) بررسي ميكروسكوپي: نمونه رامستقيماً به لام شمارش منتقل نموده و گلبولهاي قرمز و سفيد آن را شمارش مي نمائيم. با شمارش گلبولهاي قرمز مي توانيم به ميزان‌آلوده شدن مايع نخاع باخون پي ببريم و در نتيجه لكوسيت هاي مايع نخاع را تصحيح نماييم.
شمارش افتراقي : جهت شمارش افتراقي سلولها نمونه را با دور كم (2000) به مدت 5-3 دقيقه سانتريفوژ كرده، از رسوب آن اسمير تهيه نموده و رنگ آميزي گيمسا بر روي آن انجام مي دهيم.  براي بررسي ميكروسكوپي مايع نخاع از نظر ميكروبي از رسوب مايع نخاعي اسمير تهيه كرده و رنگ آميزي گرم از آن به عمل مي آوريم. نکته : نمونه های CSF حداکثر ظرف مدت یک ساعت پس از نمونه گیری باید کشت داده شود . نکته :برای کشت و جداسازی باکتری های پر نیاز مانند هموفیلوس و نیسریا ، از محیط های آگار خوندار و شکلات آگار استفاده می شود و مدت زمان و شرایط مناسب انکوباسیون ( تا 72 ساعت در شرایط 5% CO2 ) باید رعایت گردد.
كشت:
كشت مايع مغزي ـ‌نخاعي در محيط هاي بلادآگار و شكلات آگار در حضورCO2، 10-5% صورت مي گيرد. تمام محيط ها بايد تا 3 روز نگهداري شوند. كريپتوكوكوس نئوفورمنس در محيط بلادآگار در عرض 1 هفته رشد مي كند. در موارد مشكوك به عفونت هاي قارچي مي توانيم نمونه مغزي نخاعي را در محيطBHI كشت داده و پس از 4 ساعت محيط را بررسي نماييم. ( جهت اطلاع )     نحوه كشت:
نمونه را به مدت 15 دقيقه در دور   1500 g  سانتريفوژ كنيد.
مايع رويي را دور، رسوب را مخلوط كنيد.
روي محيط هايCA, MC, B.A و تايوگليكولات كشت دهيد. ( جهت اطلاع )
پليت ها را به مدت 72-48 ساعت در كندل جار در انكوباتور 35 درجه سانتيگراد قرار دهيد.* براي تشخيص هموفيلوس، روي پليتB.A استافيلوكوك اورئوس را به صورت خطي نشان دهيد.
محيط تايو 5 روز بررسي شده و به محض ديدن كدروت كشت هوازي، بي هوازي انجام شود ( جهت اطلاع ) نکات ایمنی:
به هنگام باز کردن درب ظرف محتوی نمونه ، از پاشیدن به اطراف خودداری نمایید.
از هرگونه خوردن و آشامیدن و کشیدن سیگار در محیط آزمایشگاه خودداری نمایید .
از هرگونه تماس مستقیم با مواد بالقوه عفونت زا بدون استفاده از پوشش محافظ خودداری کنید .
هرگونه محلول ریخته شده روی سطوح را توسط محلول هیپوکلریت سدیم 5%  ، ضد عفونی کنید تفسیر نتایج :
تشخيص مننژيت هاي مختلف باكرتيايي، قارچي،  ويروسي و سلي از موارد درخواست تست CSF است. عوامل ايجاد كننده مننژيت باكتريايي بر حسب گروه سني شامل موارد زير مي باشد:
الف) نوزادان تا 2 ماهگي : اشرشياكلي سالمونلا استرپتوكوك بتا هموليتيك گروه B ليستريا منوسيتوژن ب) ساير گروه هاي سني : هموفيلوس آنفولانزا نايسريا مننژيتيديس استرپتوكوك پنومونيه مايكوباكتريوم توبركلوزيس ليستريا منوسيتوژن استافيلوكوك   دستورالعمل روش انجام آزمايش  Wound Discharge S & C نمونه لازم و موارد رد نمونه :
نوع نمونه : ماده چركي يا بافت
نحوه جمع آوری نمونه:
ابتدا اطراف زخم را ضد عفونی نمایید.
آسپراسیون ماده چرکی سلول از عمق زخم با یک سوزن استریل و سرنگ
تهی­ه گسترش از ماده چرکی آسپیره شده
کشت بر روی محیط­های جامد لوازم مورد نیاز :
لام
لامل
لوله حاوي محيط انتقالي
محيط كشت
سواب استريل
ميكروسكوپ   اساس آزمایش :
روش انجام آزمایش :
آزمايش مستقيم:‌
از ماده چركي آسپيره شده گسترش تهيه كرده، آن را رنگ آميزي گرم و مورد بررسي ميكروسكوپي قرار مي دهيم.
اگر در گسترش تهيه شده حاصل ازنمونه چرك، باكتري مشاهده نشد ياتعداد كمي باكتري گرم مثبت شبيه كورينه باكتريوم ديده شود از نمونه رنگ آميزي اسيد فست بهتر است به عمل آيد در مواردي كه زخم ناشي از گزش حيوانات باشد بايد در جستجوي پاستورلا مولتوسيدا هم در لام رنگ آميزي شده باشيم.
هنگامي كه احتمال سياه زخم بدهيم بايد به دنبال پيدا كردن باسيل شاربن از گسترش باشيم.
كشت:
كشت بر روي محيط هاي بلاد آگار، مك كانكي ومحيط آب پپتونه و تايوگليكولات انجام مي شود.
در عفونت هاي پلور و آرتريت و سلوليت مخصوصاً در كودكان زير 5 سال علاوه بر محيط هاي مذكور در محيط شكلات آگار جهت بررسي هموفيلوس آنفولانزا نمونه را كشت مي دهيم .
گرفتن هم زمان كشت خون در زخم ها مي تواند در تشخيص عامل بيماريزا مفيدباشد. از محيط كشتNNN براي كشت نمونه هاي مشكوك به ليشمانيوز جلدي استفاده مي نماييم. ( جهت اطلاع )

تفسیر نتایج :
پس از انكوباسيون در شرايط هوازي و بي هوازي براي 48-24 ساعت، غالباً ‌باكتري هاي شايعي چون استافيلوكوك اورئوس،‌سودوموناس ائروژينوزا و استرپتوكوك بتا هموليتيك رشد مي كنند . که در صورت مشاهده گزارش می شوند.   ترشحات چشم- گوش- بيني- مجرا- واژن- پوستولهاي بدن  اين نمونه‌ها را حتماً كشت مستقيم داده و ايزوله مي‌كنيم (روي بلاد آگار و مكانكي آگار) در مورد مجرا حتماً روي شكلات آگار كشت مي‌دهيم و سوآپ مربوط را داخل محيط تايو مي‌بريم و يك لام نيز تهيه مي‌كنيم.  

بررسی نمونه های دستگاه تناسلی در زنان باردار از نظر استرپتوکوکوس آگالاکتیه:
استرپ گروه  B ( GBS ) از مهمترین عوامل ایجاد بیماری و مرگ و میر نوزادان و تب های بعد از زایمان مادران محسوب می شود. عفونت می تواند از مادر آلوده در حین زایمان به نوزاد منتقل شود ، بنابراین یک روش سریع برای شناسایی در زنان باردار در هنگام زایمان مورد نیاز است. جهت تشخیص نمونه ها ابتدا بر روی محیط بلاد آگار حاوی 5 % خون گوسفند کشت داده شدند و در دمای 37 درجه و CO2 5% به مدت 24 ساعت قرار داده شدند ، کلنی های کوچک ، موکوئیدی و دارای فعالیت با آزمایش کاتالاز ، رنگ آمیزی گرم ، آزمایش CAMP و مقاومت به دیسک باسیتراسین دسیک STX  تشخیص داده شدند. استرپتوکوکوس های گروه B بدست آمده همگی کاتالاز منفی ، همولیز بتا و واکنش CAMP مثبت داشته و مقاوم به دیسک باستراسین و دیسک SXT بودند. نکته :  نمونه های دستگاه تناسلی در زنان باردار از نظر وجود استرپتوکوکوس آگالاکتیه بررسی می شود.        
کشت نمونه های تناسلی
جمع‌آوري و انتقال نمونه‌ها :
الف)مجراي ادرار: خروج ترشحات از مجراي ادراري هر دو جنس زن و مرد كه با پاتوژن هاي حقيقي مانند نايسريا گونوره و تريكوموناس واژيناليس آلوده شده‌اند ديده مي‌شوند. در زنان چون ترشحات مجراي ادراري كمتر است براحتي توسط ترشحات واژن پوشيده مي‌شود. در زنان وجود عفونت معمولا بدون علامت است. همچنين اوره پلاسما اوره آليتيكوم و كلاميديا تراكوماتيس را مي‌توان از ترشحات مجراي ادراري در مردان جدا نمود. جهت جمع‌آوري نمونه از سواب‌هاي اوروژنيتال طراحي شده جهت چنين نمونه‌هائي بايد استفاده نمود.‌اين سوابها از كتان يا ابريشم ساخته شده و داراي زغال جهت جذب مواد سمي‌در مورد گنوكوك مي‌باشند. سر كتاني يا ابريشم به انتهاي يك تكه چوب يا پلاستيك نازك بسته مي‌شود. سواب‌هاي دسته چوبي ممكن است براي مايكوپلاسما يا كلاميديا سمي ‌باشند. سواب‌هاي دسته پلاستيكي سميت كمتري دارند. علاوه بر‌اين براي جدا كردن مايكوپلاسما و كلاميديا از سواب‌هائي استفاده مي‌شود كه سر كتاني آنها به يك سيستم نازك متصل است. سواب‌هاي كلسيم آلژينات عموماً نسبت به سواب‌هاي كتاني جهت هرپس ويروس ، گنوكوك، و مايكوپلاسما سمي‌تر هستند. ب)نمونه گيري از مجراي ادراري مردان :  سواب را تقريباً به‌اندازه CM2 در داخل مجرا فرو برده و قبل از خارج كردن آنرا در داخل مجرا كاملاً بچرخانيد. از آنجائيكه كلاميديا پاتوژنهاي داخل سلولي هستند بنابراين خارج ساختن سلولهاي اپي تليال بوسيلة سواب از مخاط مجراي ادرار مهم است. جدا كردن نمونه براي كشت دادن گنوكوك و كلاميديا يا اوره پلاسما ضروريست. در مواردي كه ترشحات مجراي ادرار زياد باشد مي‌توان بدون وارد كردن سواب به داخل مجرا ترشحات آنها را جمع‌آوري نمود.
ج) نمونه گيري از مجراي ادراري زنان :  كشت مجرا در زنان تا يك ساعت پس از دفع ادرار نبايستي گرفته شود. ترشحات را بوسيلة فشار و مالش مجرا از سمفيزپوبيس به طرف واژن تحريك كنيد از طريق ماساژ دادن ناحية ژنيتال بوسيلة يك گوي كتاني نيز موكوسها خارج مي‌شوند، با استفاده از سواب مخصوص كه شرح داده شد، سواب را بداخل كانال مجرا (به‌اندازه cm2) فرو برده و بچرخانيد. بگذاريد بمدت 30 ثانيه بماند سپس آنرا خارج نمائيد. همچنين از يك برس كوچك (برس مخصوص مطالعات سلول شناسي) براي اطمينان از جمع‌آوري مواد سلولي ممكن است استفاده شود. اما استفاده از‌اين وسيله با كمي‌ناراحتي (احساس درد) و خونريزي همراه است.
د)واژن : با استفاده از اسپيكولوم نموه را از ديواره خلفي واژن تهيه نمائيد و در صورتيكه پردة بكارت دست نخورده است از سوراخ واژن نمونه گيري نمائيد. علاوه بر نمونه گيري از سرويكس كه مخصوصاً براي جدا كردن هرپس ويروس گنوكوك و كلاميديا مفيد است نمونه گيري از واژن نيز ممكن است جهت جداسازي تريكوموناس، مخمرها و عوامل باكتريال مولد واژينوزباكتريال (احتمالا تركيبي است از گاردنرلاواژيناليس و انواع باكتريهاي بيهوازي) انجام گيرد. فقدان سلولهاي التهابي (لكوسيت‌ها) در ترشحات واژن دلالت بر واژينوزباكتريال دارد (قبلا واژنيت غيراختصاصي Nonspecific vaginit ناميده مي‌شد). سواب‌هاي گرفته شده جهت كشت گنوكوك باستي در محيط‌هاي ترانسپورت stuart يا Amies charcoal به آزمايشگاه انتقال يابند.‌اين محيط‌ها را تا زمانيكه به محيط كشت مناسب تلقيح نشده‌اند بايستي در دماي اتاق نگهداري شوند. اگر‌اين سواب‌ها در طول 24 ساعت پس از جمع‌آوري نمونه كشت داده شوند ممكن است بازيافت گنوكوك را افزايش دهند. در مواردي كه نمونه‌هايش از 24 ساعت مي‌مانند بايستي مستقيماً به يكي از محيط‌هاي كشت مناسب تلقيح شوند. سواب‌هايي كه براي جداسازي كلاميديا و مايكوپلاسما مورد استفاده قرار مي‌گيرند بايستي در محيط ترانسپورتي كه حاوي بافر، ساكاروز و آنتي بيوتيك است قرار داده شوند. اگر نمونه‌ها بمدت چندين ساعت كشت نشوند بايد بدون آنكه يخ بزنند آنها را در يخچال قرار داد.
آزمايش مستقيم نمونه گرفته شده از ترشحات مجرا علاوه بر كشت بايستي بوسيلة رنگ آميزي گرم از نظر وجود ديپلوكوكهاي گرم – منفي داخل سلولي مورد بررسي قرار گيرند، كه معمولا در مردان نشان دهندة سوزاك است. بعد از كشت سواب بر روي محيط‌هاي اختصاصي، سواب را  روي لام به وسعتي به‌اندازه 2cm  1 مي‌چرخانند. اگر رنگ آميزي گرم مشخص كننده باشد ديگر نيازي به كشت نيست. از چنين نمونه‌هائي در ميان مردان هموسكوئل بطور گسترده‌اي نايسريا مننژيتيديس‌ايزوله شده، بنابراين در ميان‌اين بيماران فرض‌اينكه ديپلوكوك گرم – منفي ديده شده در زير ميكروسكوپ نايسريا گونوره باشد زياد معتبر و قابل اطمينان نيست. همچنين گسترش‌هاي تهيه شده از مجراي ادرار زنان جهت تشخيص احتمالي سوزاك زماني قابل اعتماد است كه شخص آزمايش كننده با تجربه باشد. گاهي فلور نرمال واژن مثل ويلونلا (Veillonella) يا كوكوباسيل‌هاي گرم – منفي اتفاقي ممكن است شبيه گنوكوك به نظر برسند. اگر ارگانيسم‌هاي خارج سلولي شبيه نايسريا گونوره در گسترش رنگ آميزي شده مشاهده شوند، شخص آزمايش كننده بايستي گسترش را جهت مشاهده ديپلوكوك‌هاي گرم – منفي داخل سلولي مدتي بررسي نمايد. كشت يا روش تشخيص آنتي ژن بايد هميشه روي نمونه‌اي كه از زنان گرفته مي‌شود، انجام گردد. برخي از گونه‌هاي خاص نايسريا گونوره نسبت به وانكومايسين موجود در محيط كشت انتخابي حساسند، بنابر‌اين اگر ارگانيسم‌هاي مشكوكي كه در گسترش مشاهده شدند در محيط كشت رشد نكردند، كشت بايستي مجدداً روي شكلات آگار بدون آنتي بيوتيك انجام شود. بررسي مستقيم ميكروسكوپي از ترشحات واژن بصورت مرطوب ساده ترين روش سريع جهت تشخيص تريكوموناس واژيناليس است. در دو سوم نمونه‌هايي كه بصورت تازه تهيه شده باشند، توسط يك تكنسين ماهر روفوزوئيت‌هاي متحرك تريكوموناس واژيناليس مشاهده مي‌شود. همچنين سلولهاي جوانه‌دار مخمرها و رشته‌هاي كاذب آنها به آساني قابل تشخيص است. اضافه كردن محلول 10% هيدروكسيد پتاسيم به يك لام آماده شده ديگر دو كاربرد دارد:
1- با حل كردن پروتئين سلولهاي ميزبان باعث افزايش ديد عناصر قارچي مي‌شود. 2
– با قليائي كردن ترشحات واژن سبب‌ايجاد بوي ماهي يا شبيه آمين (Amine like odor) مي‌گردد كه نشان دهنده واژينوباكتريال است. مشخصة واژينوز باكتريال ترشحات چركين و بودار است كه بوسيلة روشهاي آزمايشگاهي و علائم باليني تشخيص داده مي‌شوند.‌اين ترشحات شامل سلولهاي نكروتيك اپي تليال است كه تعداد زيادي از آنها كاملاً بوسيلة باسيل‌هاي نازك و كوكوباسيل‌هاي گرم متغير پوشيده شده‌اند،‌اين سلول‌ها Clue cell يا سلول راهنما ناميده مي‌شوند. گاردنرلا واژيناليس بطور مشخصي با‌اين سندروم همراه بوده، اما فعاليت سينرژيستيك تعدادي از ارگانيسم‌هاي بيهوازي مانند گونه‌هاي باكترئيدس غير از باكتروئيدس فراژيليس و استرپتوكوكهاي بيهوازي و شايد گونه‌هاي موبيلونكوس (mobiluncus species) بنظر مي‌رسد كه به بيماريزائي آن كمك نمايد.هر چند گاهي گاردنرلاواژيناليس را مي‌توان روي پليت‌هائي كه حاوي دو لايه خون انسان هستند كشت داد و كلني‌هاي جدا شده را در عرض يك ساعت تشخيص داد ولي تشخيص باليني واژينوز باكتريال با استفاده از 3 يا تعداد بيشتري از معيارهاي زير بهتر صورت مي‌گيرد: ترشحات خاكستري رنگ هموژن  مشاهده Clue cell به روش گسترش مرطوب يا رنگ آميزي گرم استشمام بوي آمين يا ماهي گنديده بوسيلة اضافه كردن يك قطره KOH 10% به ترشحات روي لام يا اسپيكولوم و pH بالاتر از 5/4 ترشحات واژن  كاهش يا فقدان لاكتوباسيل‌ها در رنگ آميزي گرم كه به طور غالب در حالت طبيعي در ترشحات واژن سالم وجود دارند يكي ديگر از علائم واژينوز باكتريال است. يك سيستم درجه بندي رنگ آميزي گرم ترشحات واژن بوسيلة Hiller و همكاران توصيف شده است.
(روش زیر) كشت و بررسي آزمايشگاهي نمونه‌هاي واژن و مجراي ادرار:
جهت‌ايزوله كردن گنوكوك نمونه‌ها ممكن است مستقيماً به محيط كشت تلقيح شوند، كه نياز به محيطهاي ترانسپورت را برطرف مي‌كند.بسياري از ميكروبيولوژيست‌ها نمونه را مستقيماً به يك پليت استاندارد تلقيح مي‌كنند (در صورت فراهم بودن انكوباتور). محيط كشت اصلاح شده تايرمارتين (MTM) معمولا بيشتر مورد استفاده قرار مي‌گيرد. سالهاي زيادي شكلات آگار با پيتون و عصاره مخمر جهت جداسازي نايسريا گونوره مورد استفاده قرار مي‌گرفت. در سال 1964 تاير و مارتين آنتي بيوتيك پلي ميكسين B و ريستوستين را جهت سركوب باكتريهاي آلوده كننده به كار بردند. بعداً تايرومارتين محيط را بوسيلة جايگزيني محلولهاي جديد ضد ميكروبي مانند كوليستين، نيستاتين و وانكومايسين (VCN) و جايگزيني تركيبات جديد شيميايي به جاي عصاره مخمر تغيير دادند. روي‌اين محيط نايسريا گونوره يا مننژيتيديس رشد كرده از رشد ساير نايسريا‌ها و سودوموناس و پروتئوس جلوگيري بعمل مي‌آيد. در سال 1971 تغييراتي بوسيلة ليسترومارتين جهت اهداف كشت و انتقال روي‌اين محيط انجام شد (MTM).‌اين فورمولاسيون جديد شامل دو برابر شدن غلظت آگار و افزايش غلظت گلوكز مي‌باشد. محيط ترانسگرو شامل يك بطري شيشه‌اي حاوي محيط MTM به صورت شيب‌دار است و گاز كربنيك جهت افزايش بازيافت نايسرياهاي سخت رشد در طي انتقال از مطب پزشك يا كلينيك به آزمايشگاه ميكروبشناسي در آن وجود دارد. با اضافه نمودن تري متوپريم لاكتات به محيط ترانسگر و خاصيت انتخابي آن جهت ممانعت از پخش شدن پروتئوس افزايش يافت. يك مرحله انكوباسيون اوليه پيش از انتقال محيط جهت گرفتن نتايج مطلوب لازم است. محيط نيويورك سيتي (New yourk city medium) داراي چهار آنتي بيوتيك كوليستين، وانكومايسين، تري متوپريم لاكتات و نيستاتين يا آمفوتريسين B مي‌باشد. در سال 1974 مارتين و آرمسترانگ سيستم جديدي را جهت توليد گاز دي اكسيد كربن ابداع نمود.آنها گزارش كردند كه استفاده از قرص اسيدسيتريك و  در كيسه پلاستيكي حاوي محيط كشت و انكوباسيون آن در 35 درجه سانتيگراد با موفقيت همراه بوده است. رطوبت موجود در كيسه توليد دي اكسيد كربن را تسريع مي‌كند. پيشرفت ديگر استفاده از پليت‌هائي است كه در مركز آن حفره‌اي جهت قرار دادن قرص توليد كننده دي اكسيد كربن وجود دارد. در محيط (Jembec plate)  قرص توليد كننده گاز كربنيك در داخل كيسه پلاستيكي كوچكي قرار داده شده كه 2Co لازم جهت رشد ميكروارگانيسم را در پليت فراهم مي‌كند. در سال 1917 مارتين و لوئيس تغييراتي را در محيط MTM‌ايجاد نمودند. آنها غلظت وانكومايسين را از 3 ميكروگرم در ميلي ليتر به 4 ميكروگرم در ميلي ليتر افزايش داده و‌اينزومايسين را به خاطر اثر مهار كنندگي بيشتر بر روي مخمرها جانشين نيستاتين نمودند.‌اين محيط امروزه بنام Improved TM  يا محيط مارتين لوئيس (ML) شناخته مي‌شود. محيط MTM معمولا بيشتر مورد استفاده قرار مي‌گيرد. ما اگر چه محيط NYC مزيت بيشتري نسبت به محيط قبلي دارد و آن‌اين است كه باعث تقويت رشد مايكوپلاسما به خوبي گنوكوك مي‌گردد. رشد عالي گنوكوك زماني ميسر است كه نمونه‌ها مستقيماً به‌اين محيط كشت‌ها يا اصلاح شده آنها مثل محيط ترانسگرو يا Jembec plate تلقيح شوند (اين محيط‌ها به صورت تجاري در دسترس هستند). سواب حاوي نمونة مورد نظر را روي آگار چرخانده بطوريكه روي تمام سطح محيط اثر گذارد. شيشه‌هاي حاوي محيط ترانسگرو با اتمسفر بالاي Co2 پر شده‌اند و بايد در طي كشت دادن به طور عمودي نگه داشته شوند و‌اين كاري است كه در اكثر آزمايشگاههاي شلوغ فراموش مي‌شود. ممكن است مادة ترشحي را از نظر تريكوموناس واژيناليس روي محيط دياموند (Diamond) كشت دهند يا براي بررسي تروفوزوئيت نمونه مرطوب تهيه كنند و يا با نشاندار كردن آنتي بادي با مواد فلوئورسنت (DFA) آن را شناسائي كنند. DFA نسبت به كشت از نظر حساسيت در درجه دوم قرار دارد. نمونه بايد علاوه بر كشت در محيط‌هاي انتخابي گنوكوك در محيط‌هاي ديگر جهت جدا كردن قارچها، استروپتوكوك، مايكوپلاسما و گاردنرلا واژيناليس بايد كشت داده شوند.
کشت نمونه های تنفسی :
سایر نام ها:
اسمیر و کشت مجاری تحتانی تنفسی، اسمیر و کشت دستگاه تنفسی تحتانی، کشت باکتریهای هوازی ریوی، کشت و اسمیر خلط Sputum Smear&Culture, Endotracheal Smear&culture, Bronchoalveolar Lavage (BAL), Transtracheal Aspirate (TTA). Aerobic Bacterial Culture, Respiratory, General Bacteria Culture, Sputum نوع نمونه قابل اندازه گیری: خلط، ترشحات مجاری تنفسی تحتانی نظیر آسپیراسیون از طریق نای (TTA)، لاواژ برونش (BAL)، ساکشن اندوتراشه. حجم نمونه مورد نیاز:  2ml جمع آوری ، انتقال و آماده سازی نمونه: نمونه لاواژ برونش (BAL)، آسپیره یا شستشوی برونش: ظرف جمع آوری: ظرف استریل در پیچ دار دستورالعمل های ویژه: کشت بی هوازی تنها زمانی امکان پذیر است که از کاتتر پوشش دار استفاده شده باشد. شرایط انتقال به آزمایشگاه: ظرف 24 ساعت در دمای اتاق شرایط نگهداری پیش از انجام آزمایش: 24 ساعت در 4oC محیط های اصلی کشت: بلاد اگار، شکلات آگار، مک کانکی آزمایش میکروسکوپی: رنگ آمیزی گرم و در صورت درخواست، رنگ آمیزی های اختصاصی مانند آنتی بادی فلورسنت مستقیم برای لژیونلا و رنگ آمیزی اسیدفاست سایر ملاحظات: کشت کمی برای BAL و باکتری های اسیدفاست، لژیونلا، نوکاردیا، مایکوپلاسما، پنوموسیستیس، سایتومگالوویروس. نمونه خلط،
آسپیره تراشه:
ظرف جمع آوری:  ظرف استریل در پیچ دار آماده سازی بیمار: قبل از نمونه گیری خلط، بیمار مسواک زده و سپس با آب غرغره نماید. دستورالعمل های ویژه: نمونه گیری خلط با سرفه عمیق انجام شود؛ کیفیت نمونه، با استفاده از رنگ آمیزی گرم مورد ارزیابی قرار گیرد؛ خلط حاصل از تحریک در کودکان به واسطه استفاده از سرم فیزیولوژی، ممکن است آبکی باشد. شرایط انتقال به آزمایشگاه: ظرف 1 تا 3 ساعت در دمای اتاق
شرایط نگهداری پیش از انجام آزمایش: 1 تا 3 ساعت ( در مورد باسیل های اسیدفاست: 24 ساعت) در 4oC محیط های اصلی کشت: بلاد اگار، شکلات آگار، مک کانکی آزمایش میکروسکوپی: رنگ آمیزی گرم و در صورت درخواست، رنگ آمیزی های اختصاصی مانند آنتی بادی فلورسنت مستقیم برای لژیونلا و رنگ آمیزی اسیدفاست سایر ملاحظات: باکتریهای اسیدفاست، نوکاردیا
نمونه گیری: معمولی ترین نمونه ای که از بخش تحتانی مجرای تنفسی بدست می آید نمونه خلط است. بهترین نمونه خلط صبحگاهی می باشد که برای جمع آوری آن ابتدا بایستی دهان را با آب معمولی شسته و سپس با سرفه های عمیق خلط را در یک ظرف استریل دهان گشاد جمع آوری نمود. در صورتیکه بیمار قادر به خارج ساختن خلط نباشد با زدن به سینه بیمار و ورود ترشحات برونش به ریه و یا با خواندن مقداری محلول نمک غلیظ (سرم فیزیولوژی) بیمار را وادار به سرفه و در نتیجه خروج خلط می کنند. در بیماران مبتلا به سل ریوی که خلط تولید نمی کند می توان به وسیله سواب از حنجره یا شستشوی معده باسیل های سل را بدست آورد. در بیماران مبتلا به عفونت شدید ریوی که در کشت خلط خود دارای باکتریهای متعدد پاتوژن هستند برای جداسازی باکتری های بیماریزای مجاری تحتانی تنفسی می توان از آسپیراسیون نای و آزمایش میکروسکوپی و کشت خلط از محتویات آن استفاده نمود. از این روش نمونه برداریدر مواردی که بیمار نتواند خلط بیرون دهد یا بیمار با باکتریهای بی هوازی یا میکروارگانیسم های غیر شایع (اختلالات ایمنی و آبسه ریوی) آلوده شده باشد استفاده می کنند. آسپیراسیون نای در اختلالات خونریزی دهنده، سرفه های غیر قابل کنترل و بیمارانی که همکاری ندارند ممنوع می باشد. . نمونه باید حداکثر 3-1 ساعت پس از جمع آوری مورد آزمایش و کشت قرار گیرد. منبع نمونه باید در برگه آزمایش ذکر گردد. موارد عدم پذیرش نمونه: ü      نمونه بدون برچسب یا با برچسب اشتباه ü      نبودن نمونه یا کم بودن آن ü      انتقال و نگهداری نامناسب نمونه ü      نمونه گیری غلط از بیمار کاربردهای بالینی: تشخیص علل عفونت مجاری تنفسی تحتانی. عفونتهای مجاری تنفسی تحتانی شامل برونشیت، آبسه های ریوی، پنومونی، برونکوپنومونی، سل ریوی و تورم پرده جنب می باشد. نکته : جهت تفسیر نتایج کشت نمونه هایی از قبیل آسپیراسیون تراشه و Bronchoalveolar lavage  (BAL) کلنی کانت انجام می شود. توجه : کلنی کانت به روش رقیق سازی یا با استفاده از لوپ کالیبره انجام می شود.             دستورالعمل روش اطلاع رسانی در صورت نیاز به نمونه گیری مجدد:

در صورت عدم تطابق نمونه از لحاظ ظاهری با شرایط استاندارد و یا عدم تطابق جواب کشت با لام مستقیم توسط مسئول بخش میکروب به پذیرش اطلاع داده می شود و در لیست درخواست آزمایشات تکراری نوشته می شود  تا با آزمایشگاه ارسالی جهت فرستادن نمونه مجدد هماهنگی بعمل آید. در مورد بیمارن سرپایی نیز پس از بررسی شرح حال بیمار و اطلاع از مصرف آنتی بیوتیک، در صورت نیاز به پذیرش اطلاع داده می شود تا با بیمار تماس گرفته شود و پس از آموزش نمونه گیری صحیح ،  نمونه گیری مجدد انجام شود.    
دستورالعمل ساخت محلول کنترل کیفی نیم مک فارلند:
مواد لازم: پودر  2H20  . Bacl 2   آب مقطر اسید سولفوریک 1 % سرم فیزیولوژی  سواپ لوازم وتجهیزات مورد نیاز: اسپکتروفتومتر 3. شرح عملیات :  3.1. تهیه لوله استاندارد کدورت نیم مک فارلند : محیط نیم مک فارلند محیطی در تست آنتی بیوگرام است که میزان کدر  بودن نمونه خود را با آن مقایسه می کنیم. این محیط حاوی۱۰۸ × ۱.۵  باکتری است . 1/73 gr  از پودر 2H20  .Bacl 2  (کلراید باریم دو آبه) را در 100 ml  آب مقطر حل می کنیم.به 99.4 ml  از اسید سولفوریک 1 % (99 ml  آب مقطر + 1 ml اسید سولفوریک غلیظ)  مقدار 0.6 ml  محلول کلریدباریم اضافه می کنیم در طول موج 625 ml  اسپکتروفتومتر در مقابل بلانک آب مقطر OD استاندارد کدورت را می خوانیم باید بین 0.08-0.13   باشد چنانچه بیشتر بود با افزودن اسید سولفوریک 1 % رقیق و چنانچه کمتر بود با افزدون 10-20  میکرولیتر از محلول کلرید باریم کدورت را تنظیم می نمائیم. پایداری این محلول حدود سه ماه می باشد در صورت استفاده طولانی مدت باید از نظر برقراری OD  کدورت کنترل کیفی و مورد ارزیابی مجدد قرار گیرد.   3.2.  تهیه سو سپانسیون باکتری جهت تلقیح به محیط کشت مولر هینتون آکار: مقدار 4-5  سرم فیزیولوژی یا آب مقطر استریل در لوله های در پیچ دار به شکل اماده تهیه کنید. مقدار4-5  کلنی تک ومشابه از باکتری مورد نظر را به این لوله منتقل کرده وخوب مخلوط نمایید تا کلنی ها کاملاً حل شود. کدورت آنرا با استاندارد نیم مک فارلند مقایسه نمایید. از یک کاغذ سفید که خط سیاه روی آن کشیده شده استفاده می کنیم بعد از 10 دقیقه سوسپانسیون را در جای ثابتی گذاشته و سپس با سمپلر 200 لاندا از آن را روی محیط می ریزیم. یا بوسیله سوآپ پنبه ای که با دیواره لوله آب آن گرفته شده کشت متراکم روی محیط مولر هینتون پاساژ میدهیم. چنانچه کدورت بیشتر بود بوسیله آب مقطر یا سرم فیزیولوژی استریل آنرا تنظیم نمایید.(قطر هاله عدم رشد کمتر می شود) اگر کدورت کمتر بود با حل کردن کلنی بیشتر انرا تنظیم نمایید. (قطر هاله عدم رشد بیشتر می شود) حال با خیساندن سواپ استریل در این سوسپانسیون وآبگیری سواپ با فشردن به جداره لوله، تلقیح به محیط مولر هیلتون اگار را انجام می دهیم. 4 – توالی انجام : با توجه به اینکه این محلول در شرایط آزمایشگاهی 3-6 ماه می باشد لذا پس از این مدت می بایست بصورت هفتگی مورد بررسی وکنترل کیفی قرار بگیرد. بدین صورت که جذب نوری محلول را در طول موج 625 نانومتر در مقابل بلانک آب مقطر اندازه گیری کنید. محدوده قابل قبول  OD=0.08  –  0.13  می باشد. در غیر اینصورت باید لوله نیم مک فارلند تعویض گردد.
عفونت های مقاوم ناشی از باکتری :
در آزمایشگاه عفونت های مقاوم ناشی از باکتری های MDR (Multidrug resistant ) ، XDR ( Extensively drug resistant ) ،  PDR ( Pandrug resistant ) به عنوان نتیجه بحرانی محسوب می شود و در اسرع وقت جواب به بیمار یا پزشک معالج ( بیماران بیمارستانی ) اطلاع داده می شود MDR : باکتری هایی که حداقل به سه آنتی بیوتیک از سه کلاس مختلف مقاوم باشند. XDR : باکتری هایی که تنها به یک یا دو آنتی بیوتیک از کلاس ها ی مختلف حساس باشند. PDR : باکتری هایی که به تمامی آنتی بیوتیک های مورد آزمایش مقاوم باشند. سودوموناس آئروژينوزا، یک باکتری گرم منفی است که این باکتری از عوامل مهم عفونت های بیمارستانی، خصوصاً در بیماران دارای سوختگی می باشد. اهمیت بیشتر بدلیل مقاومت ذاتي آن نسبت به بسياري از آنتي بيوتيک ها است، بطوریکه در حين درمان نیز به سرعت در برابر دارو مقاوم مي گردد. بطورکلی این باکتری جهت ایجاد مقاومت دارویی از مکانیسم های متعددی مانند تولید آنزیم بتالاکتاماز ، بیان پمپهای افلوکس و تغییر تراوایی غشاء خارجی خود استفاده می نماید. امروزه مشخص گردیده است که مقاومت آنتی بیوتیکی در این باکتری نتیجه سینرژیسم بین عدم نفوذپذیری غشاء و مقاومت چند دارویی پمپ های افلوکس می باشد. هدف از اين مطالعه بررسی مقاومت های چند گانه( MDR )و مقاومت کلی( PDR ) آنتی بیوتیکی در سودوموناس آئروژينوزا و شناسائی مقاومت های ایجاد شده از طریق ژن هايMexAB در پمپ efflux توسط تکنیک PCR است. بررسی مقاومتهای چندگانه آنتی بیوتیکی (MDR) ، در نمونه های سوختگی و زخم ، نشان داد که این مقاومت در عفونتهای سوختگی بیشتر از عفونتهای زخم بود. حتی مقاومت کلی(PDR) ، هم در عفونت های سوختگی مشاهده شد در صورتی که در عفونتهای زخم مشاهده نگردید.      
عفونت استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی سیلین (MRSA ) MRSA :
توسط استافیلوکوک اورئوس ایجاد میشود و به اکثر آنتی بیوتیک ها مقاوم است.این عفونت باعث ایجاد سلولیت،زرد زخم،فولیکولیت و بسیاری عفونت های پوستی دیگر میشود.آسان ترین راه مبتلا شدن به MRSA،توسط تماس فیزیکی با یک جسم یا فردی آلوده به آن است.به محض اینکه فردی به این باکتری مقاوم به آنتی بیوتیک آلوده شود،نشانه های MRSA پدیدار میشوند.این باکتری به درمان با اکثر آنتی بیوتیک ها مقاومت نشان میدهد،در نتیجه بررسی سابقه ی پزشکی برای پزشکان بسیار مهم است تا بتوانند آنتی بیوتیکی را انتخاب کنند که بیشتر احتمال مقابله با این باکتری را دارد و قبل از اینکه عفونت به MRSA تبدیل شود،آن را از بین ببرند.سایر درمانها برای MRSA  باعث ایجاد عوارض جانبی میشوند.  در آزمایشگاه هایی که روش مولکولی به عنوان روش معمول در تشخیص MRSA استفاده نمی شود روش دیسک سفوکسی تین به عنوان روشی ساده و کم هزینه می تواند جانشینی مطلوب برای شناسایی ایزوله های مقاوم به متی سیلین باشد. ( در مولر هینتون همراه با نمک 2% )  
عفونت انتروکوک های مقاوم به وانکومایسین (VRE  ) :
مهمترین عفونت‌های ایجاد شده توسط انتروکوک‌ها عبارتند از: عفونت‌های مجرای ادراری، باکتریمی، اندوکاردیت و مننژیت. سویه‌های حساس را می‌توان با استفاده از آمپی سیلین و وانکومایسین درمان کرد. از دیدگاه پزشکی، انتروکوک‌ها از نظر مقاومت آنتی بیوتیکی ذاتی اهمیت دارند. برخی از انتروکوک‌ها بطور ذاتی به آنتی بیوتیک‌های بتالاکتام (پنی سیلین، سفالوسپورین‌ها و کارباپنم) و آمینوگلوکوزیدها مقاوم هستند. در دو دهه گذشته، سویه‌های انتروکوکی مقاوم به وانکومایسین (VRE) در بیماران بستری در بیمارستان‌ها افزایش یافته‌اند. برای درمان سویه‌های مقاوم به وانکومایسین، از آنتی بیوتیک‌هایی مانند کوئینوپریستین/دالفوپریستین (سینرسید) یا تیگسیکلین استفاده می‌شود     کنترل کیفی لوپ اساس آزمایش: تعیین حجم لوپ با استفاده از ماده رنگی اوانس بلو و تعیین میزان جذب نوری آن در طول موج 620 nm ابزار مورد نیاز: 1-پودر اوانس بلو که به صورت تجاری در دسترس است 2- آب مقطر 3- لوله آزمایش 4-سمپلر کالیبر شده 5-اسپکتروفتومتر یا فتومتر کالیبر شده 6-کاغذ میلیمتری روش انجام آزمایش: الف:رسم جدول جهت تعیین حجم لوپ به روش زیر عمل می کنیم 1-20mg پودر اوانس بلو رادر 10ml آب مقطر حل کرده که محلول ذخیره رنگی به غلظت 0/2g/100  به دست  می آوریم 2-6لوله آزمایش انتخاب کرده در لوله اولی 2ml آب مقطر و در 5 لوله بعدی  1ml آب مقطر می ریزیم 3-20 لاندا ماده رنگی ذخیره تهیه شده را توسط سمپلر برداشت کرده و در لوله اول می ریزیم و مخلوط می کنیم 4-از لوله اول 1ml برداشت کرده به لوله دوم می ریزیم و مخلوط می کنیم و از لوله دوم 1ml برداشت کرده به لوله سوم می ریزیم و این عمل را   تا لوله 6 انجام میدهیم و از لوله 6، 1 سی سی برداشت کرده و دور می ریزیم  رقت به صورت شماتیک زیر به دست می آید لوله شماره 6 لوله شماره 5 لوله شماره 4 لوله شماره 3 لوله شماره 2 لوله شماره 1 شماره لوله 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 2ml ميزان آب مقطر 1سي سي از لوله ش5 به ش6 1سي سي از لوله ش4 به ش5 1سي سي از لوله ش3 به ش4 1سي سي از لوله ش2 به ش3 1سي سي از لوله ش1 به ش2 20لاندا ميزان ماده رنگي استوك 1/3200 1/1600 1/800 1/400 1/200 1/100 رقت 0.3125 لاندا 0.625 لاندا 1.25 لاندا 2.5 لاندا 5 لاندا 10 لاندا ميزان ماده رنگي   از لوله شماره 6 يك سي سي دور ريخته مي شود.میزان OD هریک از 6 لوله را توسط اسپکتروفتومتردر طول موج 620nm  می خوانیم و یادداشت می کنیم پس برر روی کاغذ میلیمتری بر روی محور  افقی  رقت ها را یادداشت کرده و بر روی محور  عمودی ODهای 6 لوله یادداشت می شود تا این مرحله جدول مورد نیاز برای  تعیین حجم لوپ مورد نظر رسم می شود  
ب:تعیین حجم لوپ مورد نظر: 10 لوله انتخاب کرده و در هر لوله 1ml آب مقطر می ریزیم توسط لوپ مورد نظر که قرار است حجم آن تعیین شود ا ز محلول ذخیره 0/2g/100 مان رنگی برداشت کرده و در لوله اول می ریزیم و این برداشت را 10 بار برای 10 لوله انجام می دهیم و پس از هر برداشت لوپ را کاملا خشک می کنیم و از سوزاندن خودداری می کنیم  میزان جذب نوریOD  هر 10 لوله را توسط اسپکتروفتومتر اندازه گیری کرده و میانگین OD این 10 لوله را یادداشت میکنیم با قرار دادن میانگین OD فوق بر روی محور عمودی جدول مورد نظر که در مرحله الف رسم گردیده ضریب رقت لوپ مجهول به دست می آید .جهت تعیین تعداد کلنی در هر میلی متر مکعب ادرار باید تعداد کلنی های به دست آمده از کشت روی پلیت را روعکس ضریب رقت لوپ ضرب کرد و گزارش نمود.
دیسک گذاری روی ظرف پتری تلقیح شده : باید دیسک های آنتی بیوتیکی را  برای هر باکتری، با پنس و به دقت و به طرز یکنواخت روی ظرف پتری حاوی مولر هینتون آگار قرار داد. با فشار مختصر از تماس کامل آن با سطح آگار اطمینان حاصل نمایید. فاصله دیسک ها از مرکز یک دیسک تا مرکز دیسک مجاور نباید کمتر از  24 mmباشد. همچنین ، نزدیکی بیش از اندازه دیسک ها به لبه ظرف پتری موجب عدم هاله ، عدم رشد ( در بعضی داروها) خواهد شد. حداکثر تعداد قابل قبول دیسک روی ظرف پتری با قطر  mm  150، 12 عدد و روی ظرف پتری با قطر mm   100  ، 5 عدد است . در همه موارد بهتر است دیسک های دارای قطر هاله عدم رشد کوچکتر ( جنتامایسین ، وانکومایسین ) در کنار دیسک هایی قرار گیرند که قطر هاله عدم رشد بزرگتر (سفالوسپورین ها ) دارند ، تا احتمال همپوشانی هاله ها کمتر شود. بدلیل انتشار سریع برخی داروها ، به محض تماس دیسک با سطح آگار ، از جابه جا کردن دیسک بعد از قرارگیری در سطح آگار خودداری نمایید. در صورت نیاز باید دیسک جدیدی در ناحیه دیگری از ظرف پتری قرار دهید .   ( باید برای باکتری های کم نیاز در هرپلیت با قطر 10 سانتی متر حداکثر 5 تا 6 دیسک ، برای باکتری های پر نیاز شامل نیسریا گونوره ، هموفیلوس آنفولانزا و پارا آنفولانزا حداکثر 4 دیسک و برای نیسریا مننژیتیدیس حداکثر 2 دیسک گذاشته شود. )   توجه : استاندارد نیم مک فارلند باید حداکثر 6 ماه پس از تهیه / تولید تعویض گردد.
 
جدول کنترل کیفی دیسکهای انتی بیوگرام Table3, Accptable Limitis for Quality Control Strains Used to Monitor Accuracy of Disk Diffusion Testing of Nonfastidius Organisms (Using Muller-Hinton Medium Without Blood or other Supplements Animicrobial Disk Content Escherichia Staphyioccus Pseudomonas Escherichia Agent coil Aureus aeruginosa Coil ATTC 25922 ATTC 25923 ATTC 27853 ATTC 35218 Amikacin 30 μɡ 19-26 20-26 18-26 _ Amoxicillin-clavulanic acid 20/10  μɡ 18-24 28-36 _ 17-22 Ampicillin 10 μɡ 16-22 27-35 _ 6 Ampicillin-subactam 10/10 μɡ 19-24 29-37 _ 13-19 Azithromycin 15 μɡ _ 21-26 _ _ AzLocillin 75 μɡ _ _ 24-30 _ Aztreonam 30 μɡ 28-36 _ 23-29 _ Carbenicillin 100 μɡ 22-29 _ 18-24 _ Cefaclor 30  μɡ 23-27 27-31 _ _ Cefamandole 30  μɡ 26-32 26-34 _ _ Cefazolin 30  μɡ 21-27 29-35 _ _ Cefdinir 5  μɡ 24-28 25-32 _ _ Cefditoren 5  μɡ 22-28 20-28 _ _ Cefepime 30  μɡ 31-37 23-29 24-30 _ Cefetmet 10  μɡ 24-29 _ _ _ Cefixime 5  μɡ 2-27 _ _ _ Cefmetazole 30  μɡ 26-32 25-34 _ _ Cefonocid 30  μɡ 25-29 22-28 _ _ Cefoperazone 75  μɡ 28-34 24-33 23-29 _ Cefotaxime 30  μɡ 29-35 25-31 18-22 _ Cefotetan 30 μɡ 28-34 17-23 _ _ Cefoxitin 30  μɡ 23-29 23-29 _ _ Cefpodoxime 10  μɡ 23-28 19-25 _ _ Cefprozil 30  μɡ 21-27 27-33 _ _ Ceftazidime 30  μɡ 25-32 16-20 22-29 _ Ceftibuten 30  μɡ 27-35 _ _ _ Ceftizoxime 30  μɡ 30-36 27-35 12_17 _
Antimicrobial   Disk Content  Escherichia Staphyioccus Pseudomonas         Esherichia Agent   coil Aureus aeruginosa                Coil     ATTC 25922 ATTC 25923 ATTC 27853 ATTC 35218 Cefteriaxone   30  μɡ 29-35 22-28 17-23 _ Cefuroxime   30  μɡ 20-26 27-35 _ _ Cephalothin   30  μɡ 15-21 29-37 _ _ Chloramphenicol   30  μɡ 21-27 19-26 _ _ Cinoxacin   100  μɡ 26-32 _ _ _ Ciprofloxacin   5  μɡ 30-40 22-30 25-33 _ Clarithromycin   15  μɡ _ 26-32 _ _ Clinafloxacin   5  μɡ 31-40 28-37 27-35 _ Clindamycin   2  μɡ _ 24-30 _ _ Daptomycin   30  μɡ _ 18-23 _ _ Dirithroycin   15  μɡ _ 18-26 _ _ Doxycycline   30  μɡ 18-24 23-29 _ _ Enoxacin   10  μɡ 28-36 22-28 22-28 _ Ertapenem   10  μɡ   29-36 24-31 13-21 _ Erythromycin   15  μɡ   _ 22-30 _ _ Fleroxacin   5  μɡ   28-34 21-27 12_20 _ Fosfomycin   200  μɡ   22-3 25-33 _ _ Gatifloxacin   5  μɡ   30-37 27-33 20-28 _ Gemifloxacin   5  μɡ   29-36 27-33 19-25 _ Gentamicin   10  μɡ   19-26 19-27 16-21 _ Grepafloxacin   5  μɡ   28-36 26-31 20-27 _ Imipenem   10  μɡ   26-32 _ 20-28 _ Kanamycin   30  μɡ   17-25 19-6 _ _ Levofloxacin   5  μɡ   29-37 25-30 19-26 _ Linezolid   30  μɡ   _ 27-31 _ _ Lomefloxacin   10  μɡ   27-33 23-29 22-28 _ Loracarbef   30  μɡ   23-29 23-31 _ _ Mecillinam   10  μɡ   24-30 _ _ _         جدول کنترل کیفی دیسکهای انتی بیوگرام Antimicrobial   Disk Content   Escherichia Staphyioccus Pseudomonas           Escherichia Agent       coil Aureus aeruginosa             coil         ATTC 25922 ATTC 25923 ATTC 27853 ATTC 35218 Meropenem   10  μɡ   28-34 29-37 27-33 _ Methicillin   5  μɡ   _ 17-2 _ _ Mezlocillin   75  μɡ   23-29 _ 19-25 _ Minocycline   30  μɡ   19-25 25-30 _ _ Moxalactam   30  μɡ   28-35 18-24 17-25 _ Moxiffloxacin   5  μɡ   28-35 28-35 17-25 _ Nafcllin   1  μɡ   _ 16-22 _ _ Nalidixid acid   30  μɡ   22-28 _ _ _ Netilmicin   30  μɡ   22-30 22-31 17-23 _ Nitrofurantion   300  μɡ   20-25 18-22 _ _ Norfloxacin   10  μɡ   28-35 17-28 22-29 _ Ofloxacin   5  μɡ   29-33 24-28 17-21 _ Oxacillin   1  μɡ   _ 18-24 _ _ Penicillin   10  μɡ   _ 26-37 _ _ Piperacillin   100  μɡ   2-30 _ 25-33 12_18 Piperacillin-tazobactam   100/10  μɡ   24-30 27-36 25-33 24-30 Quinupristin-daifopristin   15  μɡ   _ 21-28 _ _ Rifampin   5  μɡ   8_10 26-34 _ _ Sparfloxacin   5  μɡ   30-38 27-33 21-29 _ Streptomycin   10  μɡ   12_20 14-22 _ _ Sufisoxazole   250  μɡ or 300 μɡ   15-23 24-34 _ _ Teicoplanin   30  μɡ   _ 15-21 _ _ Telithromycin   15  μɡ   _ 24-30 _ _ Tetracycline   30  μɡ   18-25 24-30 _ _ Ticarcillin   75  μɡ   24-30 _ 21-27 6 Ticarcillin-calavulanic acid   75/10  μɡ   24-30 2-37 20-28 21-25 Tobramycin   10  μɡ   18-26 19-29 19-25 _ Trimethoprim   5  μɡ   21-28 19-26 _ _ Trimethoprim-sulfamethoxazole   1.25/23.75μɡ   23-29 24-32 _ _ Trospectomycin   30  μɡ   10_16 15-20 _ _ Trovafloxacin   10  μɡ   29-36 29-35 21-27 _ Vacomycin   30  μɡ   _ 17-21 _ _             جدول نگهدارندهای نمونه ادرار   HCL 10% 10 ml Aldosterone, Aminoacids, Delta ALA, Ca, Cu, Cystine, HVA, 5HIAA Hydroxy prolin, 17 KS, Mg, Hg, Oxalate, Porphyrine, VMA, Zinc 17 OH prog… , Lithium, Metanephrine, Ph. Buric acid 10 grs. Aldosterone, BHCG, Citrate, Cortisol, Estrogen, HVA, 5HIAA Hydroxy prolin, 17 KS, Uric acid VMA, Albumin, BJP,Chloride Creatinine, Creatin, Estriol, Glucose, Protein Acetic acid 10 ml Delta ALA, Cortisol, Estrogen, HVA, 17 KS, VMA 17 OH prog. , Lithium, Metanephrine Toluene 10 ml Aminoacids, Citrate, Cystine, Hydroxy praline, Uric acid 2 – 4 .C Amylase, Delta ALA, Drugs, Electrolytes, FSH Freeze Aldosterone, Cystine, Osmolality, Urobilinogen None Ca, Cu, BHCG, Cortisol, Homogentistic acid, Mg, Hg Osmolality, Urobilinogen, Zinc, Arsenic, BJP, Estriol Trace elements                                                                                     جدول تشخیص افتراقی استافیلوکوک ارگانيسم خصوصيات آرئوس اپيدرميس ساپروفيتيكوس 1- وجود آنزيم كواگولاز + 2- خاصيت هموليتيك + ± 3- تخمير گلوكز در شرايط بيهوازي + + 4- حساسيت به باستيراسين حساس مقاوم مقاوم 5- حساسيت به نئوبيوسين5mg disk حساس حساس مقاوم 6- پيگمان زرد طلايي سفيد خاكستري سفيد- زرد پررنگ 7- مانيتول سالت آگاربی هوازی ++ +- – – 8- DNAse + 9- احیاء نیترات + متغییر 10- تخمیر هوازی Trehalose + + 11- فسفاتاز + +

جدول انتخاب آنتی بیوتیک جهت انجام آزمایش تعیین حساسیت میکروبی

 Enrerococcus 8pp.°Sraphylococcu6 8pp.P6eudomonas  Aoruginosa¹EnterobacterlaceaeGROUP A PRIMARY TEST  AND REPORT
 Penicillin or ampiciliinOxacillin (cefoxitin disk ) lmCeftazidineAmpicillin
  PenicillinGentamicinCefazolin Cephalothin
   Meziocillin or ticarcillin PiperacillinGentamicin
   
 Linezoid Quinupristin-dairopriadinAzithromycin or clarthromyicin or erythromycinAmilcacinAmilcacinGROUP B PRIMARY TEST REPORT SELECTIVELY
 VancomycinCilndamycinAzithromycin cefoperazoneAmoxicillin-clavulanic acid or ampicillin-gulbactam Ticarcillhi-clavulanic
  Linezoiid Cefamandole or cefonicid or cefuroxime
 Telthramycin
  Trimethoprim – SulfamethoxazoleCefepimeCefepime
  VancomycinCiprofloxacin LevofloxacinCefmetazole Cefoperazone Cefotatan Cefoxitin
   Imipeneme MeropenemeCefotaxime   or ceftizoxim    or Cefteriaxone 
   TobramcinCiprofoxacin or levofoxacin
    Ertapeneme Imipeneme or meropeneme
    Meziocillin or piperacillin Ticarcillin
    Trimethoprim- sulfamethoxazole
  
 Gentamicin (high level resistance screen only)ChloramphenlcolNetimic inAztreonam Ceftazidime (Both arehelpful indicaotors of extended-spectrum Blactamases) GROUP C SUPPLEMENTAL REPORT SELECTIVELY  
 Strepbomycin (high-level resistancescreen only)Clprofloxacin or levofloxacin or ofloxacin Gatimoxacin or moxifioxacin Chloramphenlcol
 Qulupristin  dalfopristinKanamycin
 Chloramphenlcol Erythromycin Tetracycline (These agents may be tested for VER)GentamicinNetimicine
 RifampinTetracycline
 TetracyclineTobramycin
  
 Ciprofloxacin Levoflaxcin NofloxacinLornefloxacin or norfloxacinCarbenicillinCarbenicillin GROUP U SUPPLEMENTAL FOR ONlY
 NitrofurantionNitrofurantionLomefloxacin ornarfioxacin or ofloxacinCinoxacin Lomefloxacin ornarfioxacin or ofloxacin
 TetracyclineSulrisoxazoleGatilloxacin
 Loracarbet
 Nitroturantion
 Suflaxazole  
 Trimethoprim  Trimethoprim  

جدول انتخاب آنتی بیوتیک جهت انجام آزمایش تعیین حساسیت میکروبی

در جدول آنتی بیوتیک ها در چهار گروه A,B,C,U قرار گرفته اند :

  1. گروه A: شامل آنتی بیوتیکهایی است که به عنوان انتخاب اولیه و روتین در پانل آنتی بیوگرام انتخاب می شوند .این آنتی بیوتیکها به طور روتین برای ارگانیسم های خاصی گزارش می شود .
  2. گروه B: اگرچه از آنتی بیوتیکهای این گروه نیز می توان به عنوان انتخاب اولیه در آنتی بیوگرام استفاده کرد ولی آنها را باید به طور انتخابی گزارش نمود .به عنوان مثال: زمانی که ارگانیسم به آنتی بیوتیک گروه A مقاوم باشد، می توان از آنتی بیوتیک های گروه B استفاده کرد.علاوه بر این آنتی بیوتیکهای این گروه را می توان بر اساس نوع نمونه نیز انتخاب نمود. به عنوان مثال :نسل سوم سفالوسپورینها را برای باسیل های روده ای جدا شده از مایع نخاع یا کوتریموکسازول را برای باسیل های روده ای جدا شده از ادرار، علاوه بر این در موارد عفونتهای منتشر، در صورت داشتن حساسیت به آنتی بیوتیکهای گروه A ، یا عدم پاسخ درمانی به آنتی بیوتیکهای گروه A ، می توان از آنتی بیوتیکهای گروه B استفاده نمود.
  3. گروه C:آنتی بیوتیکهای گروه C در موارد زیر کاربرد دارند:
  4. به عنوان جایگزین و یا به صورت تکمیلی در مواقعی که سویه های اندمیک یا اپیدمیک به تعداد زیادی از آنتی بیوتیکهای گروه A مقاوم باشند (به خصوص در همان کلاس به عنوان آنتی بیوتیکهای گروه  بتالاکتام ویا آمینوگلیکوزیدها ).
  5. در درمان بیماران دارای حساسیت به داروهای اولیه.
  6. درمان ارگانیسم های غیر متداول (به عنوان مثال برای درمان سالمونلاهای جدا شده خارج از دستگاه گوارش و آنتروکوکهای مقاوم به وانکومایسین).
  7. گزارش به کمیته کنترل عفونت بیمارستانی.
  8. گروهU(Urine) : این گروه شامل آنتی بیوتیکهای میتروفورانتوئین و بعضی از کینولونها می باشد که فقط برای درمان عفونتهای دستگاه ادراری استفاده می شوند. این آنتی بیوتیکها نباید به طور روتین جهت پاتوژنهای جداشده از سایر نمونه ها به غیر از ادرار گزارش شوند.بعضی از این آنتی بیوتیکهای موجود در این گروه برای ارگانیسم های خاصی مانند سودوموناس آئروژینوزا به کار میروند.
3) استاف از نمونه ادرار 1- آمپي سيلين Am 2- نيتروفورانتوئين Fm 3- كوتريموكسازول SXT 4- سفالكسين CN سفالوتين CN-CF 5- جنتامايسين Gm 6- نوروفلوكساسين NRO 4) استاف از نمونه ترشحات و خون 1- پني سيلينG P 2- اگزاسيلين OX 3- سفالوتين يا سفالكسين CN-CF 4- كوتريموكسازول SXT 5- جنتامايسين Gm 6- سيپروفلوكسازين CP 7- ونكومايسين V 8- سفوتاكسيمCTXياسفتيزوكسيم CT  9- ونکومایسین V 10-کلیندامایسین CC 11-سفوتاکسیم یاسفتیزوکسیم CTX- CT 12-گاتی فلوکساسین GA 13- لوو فلوکساسین LEV 14- لینزولید LZ    

جدول  استفاده از انتی بیوتیکها

1) ـ خانواده انتروباکتریاسه 1- آمپي سيلين Am 2- ناليديكسيك اسيد NA 3- نيتروفورانتوئين Fm 4- كوتريموكسازول SXT` 5- سفالكسين يا (سفالوتين) CF CN-CF 6- تترا سايكلين Te 7- جنتامايسين Gm 8- آميكاسين An 9- سفوتاكسيم (CT) سفتي زوكسيم CTX  خانواده انتروباکتریاسه از ترشحات و خون 1- آمپي سيلين Am 2- كوتريموكسازول SXT 3- سفالكسين يا سفالوتين CN-CF 4- جنتامايسين Gm 5- آميكاسين An 6- تتراسايكلين Te 7- سيپروفلوكسازين CP 8- سفوتاكسيم CZ 9- سفتي زوكسيم CT 10- کاربنی سیلین یا پیپیراسیلین یا تیکارسیلین      


جدول  استفاده از انتی بیوتیکها

8) سودوموناس و گرم منفی های غیر تخمیری از نمونه
1- جنتامايسين Gm 2- آميكاسين An 3- كاربني سيلين CB 4- تيكارسيلين TC 5- سفتازيديم CTZ 6- سفتي زوكسيم CZ 7- سيپروفلوكسازين CP 8-مروپنم MEM 9-ازیترومایسین E 10سفتازیدیم CTZ 11-نوروفلوکسازین NOR 12-کوتریموکسازول SXT 9) استرب B هموليتيك از نمونه 1- پني سيلين P 2- كوتريموكسازول SXT  3- ونکومایسین V 4-ازیترومایسین E 5- آمپي سيلين AM 6- سفالكسين يا سفالوتين Cp-CF    
5) استرپ از نمونه ادرار
1- پني سيلين G يا آمپي سيلين Am 2- سفالكسين يا سفالوتين CN-CF 3- كوتريموكسازول SXT 4- تتراسايكلين Te 5- نوروفلوكساسين NRO 6- نيتروفورانتوئين Fm 6) شيگلا از نمونه 1- آمپي سيلين Am 2- كوتريموكسازول SXT 3- تتراسايكلين Te 4- ناليديكسيك اسيد Na 5- سفوتاكسيم CTY 6- سفتي زوكسيم CZ 7- نوروفلوكساسين NRO 7) سالمونلا از نمونه 1- آمپي سيلين Am 2- كوتريموكسازول SXT 3- كلرامفنيكل C 4- سفوتاكسيم يا سفتي زوكسيم CTX 5- سيپروفلوكسازين CP 6- جنتامايسين Gm    


جدول  استفاده از انتی بیوتیکها

10) بروسلا از نمونه تتراسايكلين TC جنتامايسين Gm استرپتومايسين SP كوتريموكسازول SXT سفتي زوكسيم CZ 11) نايسريا از نمونه پني سيلينG PG سفوتاكسيم سفتي زوكسيم CT-CTX تتراسايكلين Te سيپروفلوكسازين CP  اسپكتينومايسين SPT سفکسیم CFM اوفلوکساسین OFX 12) هموفيلويس از نمونه تتراسايكلين Te استرپتومايسين SP سیپروفلوکساسین CP جنتامايسين Gm كوتريموكسازول SXT سفتي زوكسيم CT مروپنم MEM سفتی ریاکسون CRO امپی سیلین AM سفوتاکسیم CTX 16) Ecoli بيماري زا از مدفوع 1- كوتريموكسازول SXT 2- سفالكسين CN 3- فورازوليدون FR 4- جنتامايسين Gm 5- ـ سفالوتين CF 6- آميكاسين AN 7- ناليديكسيك اسيد NA 8- آمپي سيلين Am    13) انتروکوک از نمونه امپی سیلین Am اریترومایسین E جنتامایسین Gm پنی سیلین G PG ونکومایسین V اگزاسیلین OX استرپتو ملیسین SP 14) انتروکوک از ادرار سیپروفلوکساسین CP نوروفلوکساسین NOR نیترو فورونتویین Fm تتراسایکلین Te 15) استرپ پنومونیه پني سيلينG P سفتی ریاکسون CRO تتراسایکلین Te  ونکومایسین V كوتريموكسازول SXT مروپنم MEM سيپروفلوكسازين CP اریترومایسین E سفوتاكسيمCTXياسفتيزوكسيم CT گاتی فلوکساسین GA لوو فلوکساسین LEV سفوتاکسیم یاسفتیزوکسیم CTX-CT    

 

جدول قطر هاله

   Sr Sr NoAntimicrobial  agnentCodeConcSusceptible zone diameter
Resistance (mm or  less)Interme diate mmSensitive (mmor  more
1.AmikacinAN30µg   
When testing Enterobacteriaceae Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter spp.& Staphylococcus ssp1415-1617
2.Ampicillin /SulbactamSAM10+5µg   
When testing Enterobacteriaceae Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter spp.& Staphylococcus ssp1112-1415
When testing Haemophilus spp   
3.AmoxycillinAMX25µg   
When testing Staphylococcus spp1920
When testing Other organisms1314-1718
4.Amoxycillin/Clavulanic acidAMC20+10µg   
When testing Enterobacteriaceae1314-1718
When testing Staphylococcus spp.& Haemophilus spp1920
5.AmpicillinAM10µg12
When testing Enterobacteriaceae Vibrio cholera1314-1617
When testing Staphylococcus spp2829
When testing Enterobacteriaceae spp1617
When testing Haemophilus spp1819-2122
When testing Streptococcus spp (other than Streptococcus pneumonia) (Beta group)24
6.AzithromycinAZM15µg   
When testing Staphylococcus spp& Streptococcus spp1314-1718
When testing Haemophilus spp12
7.A ztreonamATM30µg   
When testing Enterobacteriaceae Paeudomonas aeruginosa & Acinetobacter spp1516-2122
When testing Haemophilus spp26
8.CefactorCEC30µg   
When testing Enterobacteriaceae spp Staphylococcus spp1415-1718
When testing Haemophilus spp1617-1920
9.CefadroxilCD30µg1415-1718


جدول قطر هاله

   Sr No  Antimicrobial  agnentCodeConcSusceptible zone diameter
Resistance (mm or  less)Interme diate mmSensitive (mmor  more
19CeftazidimeCAZ30µg   
When testing Enterobacteriaceae Pseudomonas aeruginosa Acinatobacter ssp& Staphylococcus spp1415-1718
When testing Haemophilus spp26
When testing Neisseria gonorrhoeae31
20CefotizoximeCT30µg   
When testing Enterobacteriaceae Pseudomonas aeruginosa Acinatobacter ssp& Staphylococcus spp1415-1920
When testing Haemophilus spp26
When testing Neisseria gonorrhoeae38
21CeftriaxoneCRO30 µg   
When testing Enterobacteriaceae Pseudomonas aeruginosa Acinatobacter ssp& Staphylococcus spp1314-2021
When testing Haemophilus spp  26
When testing Neisseria gonorrhoeae  35
When testing Streptococcus spp (Other than Streptococcus Pneumoniae) If Viridans group If beta group      24       25-26       27 24
22Cefuroxime sodiumXM30 µg   
When testing Haemophilus spp& Staphylococcus spp1415-1718
When testing Haemophilus spp1617-1920
When testing Neisseria gonorrhoeae2526-3031
23CephalexinCN30 µg1415-1718
24Cephaloridine 30 µg1112-1516
  25      CephalothinCF30 µg   
When testing Enterobacteriaceae Staphylococcus spp1415-1718


جدول قطر هاله

Sr No  Antimicrobial  agnentCodeConcSusceptible zone diameter
Resistance (mm or  less)Interme diate mmSensitive (mmor  more
10.SefazolinCZ30µg   
When testing Enterobacteriaceae Staphylococcus spp1415-1718
11CefdirinCOR5µg   
When testing Enterobacteriaceae Staphylococcus spp1617-1920
When testing Haemophilus spp  20
12CefiximeCFM5 µg   
When testing Enterobacteriaceae1516-1819
When testing Haemophilus spp  21
When testing Neisseria gonorrhoeae  31
13CefoperazoneCEP75 µg   
When testing Enterobacteriaceae Pseudomonas aeruginosa Acinatobacter ssp& Staphylococcus spp1516-2021
14Cefoperazone/SulbactamCS75+30 µg   
When testing Enterobacteriaceae Pseudomonas aeruginosa Acinatobacter ssp& Staphylococcus spp1516-2021
15CefotaximeCTX30 µg   
When testing Enterobacteriaceae Pseudomonas aeruginosa Acinatobacter ssp& Staphylococcus spp1415-2223
When testing Haemophilus spp  26
When testing Neisseria gonorrhoeae  31
When testing Streptococcus spp (Other than Streptococcus Pneumoniae) If Viridans group If beta group    25    26-27    28 24
16CefprozilCPR30 µg   
When testing Enterobacteriaceae Staphylococcus spp Haemophilus spp1415-1718
17Cefpriome 30 µg   
When testing Enterobacteriaceae2425-2728
When testing  Pseudomonas aeruginosa Acinatobacter ssp2021-2324
18CefpodoximeCPD10 µg   
When testing Enterobacteriaceae& Staphylococcus spp1718-2021
When testing  Haemophilus spp  21
When testing Neisseria gonorrhoeae    29


جدول قطر هاله

Sr No  Antimicrobial  agnentCodeConcSusceptible zone diameter
Resistance (mm or  less)Interme diate mmSensitive (mmor  more
26Chloramphenicol 30 µg   
When testing Enterobacteriaceae Pseudomonas aeruginosa Acinatobacter ssp& Staphylococcus spp Enterococcus ssp Vibrio cholerae1213-1718
When testing Haemophilus spp2526-2829
When testing Streptococcus Pneumoniae2021
When testing Streptococcus ssp (Other than Streptococcus Pneumoniae)1718-2021
27CiprofloxacinCP5 µg   
When testing Enterobacteriaceae Pseudomonas aeruginosa Acinatobacter ssp& Staphylococcus spp Enterococcus ssp1516-2021
When testing Haemophilus spp21
When testing Neisseria gonorrhoeae2728-4041
28ClarithromycinCRL15 µg   
When testing Staphylococcus spp1314-1718
When testing Haemophilus spp1011-1213
When testing Streptococcus ssp1617-2021
29CilindamycinCC2 µg   
When testing Staphylococcus spp1415-2021
When testing Streptococcus ssp1516-1819
30CloxacillinCX5 µg1112-1314
31Co-trimoxazoleSXT25 µg   
When testing Enterobacteriaceae Pseudomonas aeruginosa Acinatobacter ssp& Staphylococcus spp Haemophilus spp& Vibrio cholerae1011-1516
When testing Streptococcus Pneumoniae1516-1819
32DoxycyclineD30 µg   
When testing Enterobacteriaceae Pseudomonas aeruginosa Acinatobacter ssp& Staphylococcus spp Enterococcus ssp1213-1516
33    ErythromycinE15 µg   
When testing Staphylococcus spp Enterococcus ssp1314-2223
When testing Streptococcus ss  1516-2021


جدول قطر هاله

Sr No  Antimicrobial  agnentCodeConcSusceptible zone diameter
Resistance (mm or  less)Interme diate mmSensitive (mmor  more
34FurazolidoneFR100 µg1415-1617
35 GF5 µg   
When testing Enterobacteriaceae Pseudomonas aeruginosa Acinatobacter ssp& Staphylococcus spp Enterococcus ssp1415-1718
When testing  Haemophilus spp18
When testing Neisseria gonorrhoeae3334-3738
When testing Streptococcus ssp1718-2021
36 GM10 µg   
When testing Enterobacteriaceae Pseudomonas aeruginosa Acinatobacter ssp& Staphylococcus spp1213-1415
When testing  Haemophilus spp   
37 IPM10 µg   
When testing Enterobacteriaceae Pseudomonas aeruginosa Acinatobacter ssp& Staphylococcus spp Enterococcus ssp   
When testing  Haemophilus spp   
38StinIS10+10 µg   
When testing Enterobacteriaceae Pseudomonas aeruginosa Acinatobacter ssp& Staphylococcus spp1314-1516
When testing  Haemophilus spp16
39 K30 µg   
When testing Enterobacteriaceae& Staphylococcus ssp1314-1718
40 LOM5 µg   
When testing Enterobacteriaceae Pseudomonas aeruginosa Acinatobacter ssp& Staphylococcus spp Enterococcus ssp Streptococcus ssp1314-1617
When testing  Haemophilus spp17
41 L15 µg1314-1718


جدول قطر هاله

   Sr No  Antimicrobial  agnentCodeConcSusceptible zone diameter
Resistance (mm or  less)Interme diate mmSensitive (mmor  more
50 OFX5 µg   
When testing Enterobacteriaceae Pseudomonas aeruginosa Acinatobacter ssp Staphylococcus spp & Streptococcus ssp1213-1516
When testing  Haemophilus spp16
When testing Neisseria gonorrhoeae2425-3031
51PefloxacinPF5 µg1213-1617
52Penicillin-GP10 µg   
When testing  Staphylococcus spp2829
When testing Enterobacteriaceae1415
When testing Neisseria gonorrhoeae2627-4647
When testing Streptococcus spp (Other than Streptococcus Pneumoniae) If beta group24
53PiperacilinPIP100 µg   
When testing Enterobacteriaceae& Acinatobacter ssp1718-2021
When testing Pseudomonas aeruginosa1718
54PiperacilinTZP100+10 µg   
When testing Enterobacteriaceae& Acinatobacter ssp1718-2021
When testing Pseudomonas aeruginosa & Staphylococcus spp1718
55RoxithromycinRO30 µg910-2021
56RifampicinRA5 µg   
When testing  Staphylococcus spp Enterobacteriaceae& Haemophilus spp1617-1920
When testing S.pneumoniae1617-1819
57SparffloxacinSP5 µg   
When testing  Staphylococcus spp Streptococcus Pneumoniae1516-1819
58StreptomycinS10 µg   
When testing Enterobacteriaceae1112-1415
59SulphadiazineSD300µg   
When testing Enterobacteriaceae Pseudomonas aeruginosa Acinatobacter ssp& Staphylococcus spp Vibrio cholera1213-1617

جدول قطر هاله

Sr No  Antimicrobial  agnentCodeConcSusceptible zone diameter
Resistance (mm or  less)Interme diate mmSensitive (mmor  more
42 LNZ30 µg   
When testing  Staphylococcus spp21
When testing   Enterococcus ssp2021-2223
When testing   Streptococcus ssp21
43 LM10 µg   
When testing Enterobacteriaceae Pseudomonas aeruginosa Acinatobacter ssp& Staphylococcus spp1819-2122
When testing  Haemophilus spp22
When testing Neisseria gonorrhoeae2627-3738
44 MEN10  µg   
When testing Enterobacteriaceae Pseudomonas aeruginosa Acinatobacter ssp& Staphylococcus spp Enterococcus ssp Streptococcus ssp1314-1516
When testing  Haemophilus spp20
45 MI30 µg   
When testing Enterobacteriaceae Pseudomonas aeruginosa Acinatobacter ssp& Staphylococcus spp Enterococcus ssp Streptococcus ssp1415-1819
46 MF5 µg   
When testing Streptococcus Pneumoniae1415-1718
When testing  Haemophilus spp18
47 NA30 µg   
When testing Enterobacteriaceae1314-1819
48 FM300 µg   
When testing Enterobacteriaceae Staphylococcus spp & Enterococcus ssp1415-1617
49                   NOR10  µg   
When testing Enterobacteriaceae Pseudomonas aeruginosa Acinatobacter ssp Staphylococcus spp & Enterococcus ssp1213-1617                


جدول قطر هاله

   Sr No  Antimicrobial  agnentCodeConcSusceptible zone diameter
Resistance (mm or  less)Interme diate mmSensitive (mmor  more
60TeicoplaninTP30 µg   
When testing  Staphylococcus spp                          Enterobacteriaceae1011-1314
61TetracyclineTE30 µg   
When testing Enterobacteriaceae                        Pseudomonas aeruginosa                        Acinatobacter ssp&                        Staphylococcus spp                         Enterococcus ssp                                      Vibrio cholera1415-1819
When testing  Haemophilus spp    2526-2829
When testing Neisseria gonorrhoeae3031-3738
When testing   Streptococcus ssp1819-2223
62Ticaracillin/Clavulanic acidTIM75+10 µg   
When testing Enterobacteriaceae                        Acinatobacter ssp&1415-1920
When testing Pseudomonas aeruginosa1415
When testing  Staphylococcus spp   2223
63TobramycinTOB10 µg   
When testing Enterobacteriaceae                        Pseudomonas aeruginosa                        Acinatobacter ssp&                        Staphylococcus spp 1213-1415
64TrimethoprimTMP5 µg   
When testing Enterobacteriaceae                        Staphylococcus spp  1011-1516
65VancomycinV30 µg   
When testing  Staphylococcus spp15
When testing Enterobacteriaceae1415-1617
When testing   Streptococcus ssp17

صفات بیوشیمیایی در گونه های مهم جنس انتروباکتر

 تخمیر آدونیتولتخمیر آرژینینرشد در مجاورت KCNلیزین دکربوکسیلازاورنیتین  دکربوکسیلازتخمیر سوربیتول
انتروباکتر آئروژنز+++++
انتروباکترآگلومرانسمتغیرمتغیر
انتروباکتر کلواسهمتغیر++++
انتروباکتر ژرگوویه++
انتروباکتر ساکازاکی+++

صفات بیوشیمیایی در گونه های مهم جنس کلبسیلا

 اندلVPONPGمصرف مانولاتتخمیر در 5⁰C
کلبسیلاپنومونیا+++
کلبسیلا اوکسی توکا++++
کلبسیلا+
رینواسکلروماتیس کلبسیلا اوزنهمتغیرمتغیر

صفات بیوشیمیایی مهم برای متمایز کردن گونه های جنس شیگلا

 مانیتولONPGاورنیتین دکربوکسیلاز
شیگلا دیسانتریهمتغیر
شیگلا فلکسنری+
شیگلا بویدی+متغیر
شیگلاسونئی++

صفات بیوشیمیایی گونه های مهم در جنس سالمونلا

 سیتراتSH2لیزین دکربوکسیلازاورنیتینی دکربوکسیلازتخمیر آرابینوزتخمیر رامنوز
سالمونلا تیفی++
سالمونلا پاراتیفی A+
سالمونلا پاراتیفیB++++++
سالمونلا پاراتیفی C++++++
سالمونلا کلراسوئیسمتغیرمتغیر+++

آزمون های تشخیصی در اعضای مهم جنس استرپتوکوک

آزمون تعیین حساسیت بهتست ئیدرولیز توانایی رشد در 
 باسیتراسینکو- تریموکسازولاوپتوشینPYRهیپوراتاسکولینتست کمپ40% صفرا5/6 % نمکنوع همولیز
گروهA گروه گروه انتروکوک ویریدانس پنوموکوکحساس مقاوم مقاوم مقاوم مقاوم حساسمقاوم مقاوم متغیر مقاوم حساس حساسمقاوم مقاوم مقاوم مقاوم مقاوم حساس+ + + + + + + + بتا بتا آلفا-گاما آلفا- بتا آلفا گاما آلفا

صفات بیوشیمیایی در سه گونه مهم جنس استافیلوکوک

صفات بیوشیمیاییاستافیلوکوک اورئوساستافیلوکوک اپیدرمیدیساستافیلوکوک ساپروفیتیکوس
حساسیت به نووبیوسینحساسحساسمقاوم
تست کواگولاز+
ئیدرولیز قندمانیتول+±
تست DN ase+

Biochemical reaction of subgenera of Salmonella     برخی دیگر از اختصاصات بیوشیمیایی سالمونلاها

SubgenusTest
IVIIIIII 
++Dulcitol fermenCHtion
+Lactose fermenCHtion
+SalicCH fermenCHtion
++Malonate utilization
+KCN,growth CH
+++GelatCH liquefaction

اختصاصات بیوشیمیایی انواع سوش کلبسیلا(Klebsiella)

CHble 28.5 DistCHguishCHg reations of klebsiella species

Key:+,result positive with at laest80% of straCHs,-, result negative with at laest80% of straCHs,±,some straCHs positive,some negative ,-++,negative at 24h,delayed positive at 2-8 days

K.rhCHoscleromatisK.ozaeneK.atlanteK.edwardsiK.pneumoniaeK.aerogenesReaction
-or+(6)+(1)+(1,3)Fimbriae
±+++Glucose
++Lactose
+++++ONPG
+±++++Sucrose(acid)
+±Dulcitol(acid)
+++±+Methyl red
±++Voges-Proskauer
±+±++Citrate
±++++Urease
+++++KCN
±+±+Gluconate
+±++Malonate
±++++LysCHo docarboxylase
33-611,231-72Capsule serotypes

Result for KCN:+,growth CH KCN medium(ch.8);-,no growth                                    /:

انتروباکتریاسه

Growth CHKCNVoges-ProskauerCitrate utilizedUreaseMotilityGas from glucoseAcid from lactoseGenus
+++Esherichia
++Edwardsiella
Shigella
++±+++Citrobacter
+++Salmonella
++++++Klebsiella
+++±+++Entrobacter
+±+++Hafnia
++++±±Serratia
+±+++Proteus
++++Providencia
±++±ErwCHia
±YersCHia

اختصاصات بیوشیمیایی اشرشیا کلی(E.Coli)     Reactions of Esherichila coli

Typical reaction of E.coliTest
CHositol to acid
Oxidation of gluconate
Urease
+CHdole
+Methl red
Voges-Proskauer
Growth on citrate
StraCH identificationPathogenesisAssociated diseaseAge affectedO serogroupE.coli straCHs
TypCHg with specific antiseraUnknownCHfantile diarrhowaCHfants,rarely adults26,55,86,111,114,119, 125,126,127,128,142Enteropathogenic  straCHs(EPEC)
Provisional:typCHg with specific antisera DefCHitive:demonstration of toxCH LT:Y1 mouse adrenal assay ,CHOassey,Biken test,ELISA    ST:CHfant mouse assay,ELISAProduction of enteroxCH(LT,ST OR LT/ST) Colonization factor antigen (mannose-resisCHnt adhesion)CHfantile and adult diarrhea CH the third world Traveller’s diarrhoeaAll age6,8,15,25,27,63,78,115,  148,153,159Enterotoxigenic straCHs(EPEC)
Provisional:typCHg with specific antisera  Recognition of atypical biochemical reactions  DefCHitive:Sereny test,HeLa or HEp-2 cell assayEpithelial cell CHvasionDysenttery-like diarrhoeaAll age28ac,112ac,124,136,143  144,152,164EnteroCHvasive straCHs(EPEC)

اختصاصات استافیلوکوک ها

S.sapro-phyticusS.chohniS.haemo-lyticusS.warneriS.homCHisS.capitisS.epider-midisS.hyicusS.CHter-mediusS.aureusCharacter
+++±±++Occurrence CH man
±±±++ThermosCHble DNA nuclease
±++Coagulase produced
+±+Haemolysis on human blood
+±++±±++AcetoCH produced
+++++++++Acid produced aerobically from:sucrose
++++++++Trehalose
++±±+±+Mannitol
++++PhosphaCHse produce
++Growth on medium with 1.6 mg/litre novobiocCH
Albus Staphylococci
S.saprophyticusS.epidermidisS.aureusCharacter
Usually whiteUsually whiteYellow to orange,rarely whiteColony colour
+Coagulase
+DNase
+Mannitol fermented anaerobically
RSSNovobiocCH sensitivy

افتراق بین کوکسی های گرم مثبت خوشه ای

Ecological characterGlucose breakdownCaCHlase productionAtmospheric requirementPredomCHant groupCHgGenus
Pathogenic and commensal parasitesFermenCHtivea(acid formed anaerobically as well as aerobically)+FaculCHtivea(aerobic growth greater than anaerobic)Irregular  ( grape – like) ClustersSCHphylococcus
Free-livCHg saprophytesOxidative( acid formed only  aerobically)or CHactiveStrictly aerobicIrregular clusters or tetradsMicrococcus
Free-livCHg saprophytesFermenCHtive–  or weekFaculCHtivea(aerobic growth greater than anaerobic)Tetrads and small clutersAerococcus
Commensal parasites,opportunistic pathogensFermenCHtive or CHactivWeak or variableStrictly anaerobicIrregular clusters or tetradsPeptococcus

اختصاصات بیوشیمیایی استرپتوکوک ها Streptococci

S.mitiorS.milleriS.salivariusS.sanguisS.muCHnsCharacters
Acid production from:
+Mannitol
±+±++Trehalose
±±±+RaffCHose
±+++SalicCH
±++CHositol
+Sorbitol
Hydrolysis of:
++++AesculCH
++ArgCHCHe
+±+SCHrch
Production from sucrose:
+Levan
++Dextran

تفرق بین پنوموکوک با استرپ ویریدانس

Viridanse streptococciPneumococcusCharacter
Short or long chaCHs of rounded cocciOvoid or lanceolate diplococcic;some short chaCHsMorphology
Usually adsentPeresentCapsule
ConvexBecome  flattened or draughtsmanColonies
Wide on  narrowNarrow zones of α-Effect on
zones of α- haemolysishaemolysisblood agar
ResisCHntSensitiveOptochCH sensitivity
+Bile  solubility
+CHulCH fermenCHtion
+Virulence CH mice

حداقل مدت زمانی که برای استریلیزاسیون در مجاورت دماهای مختلف گرمای مرطوب و خشک مورد نیاز می باشد .

 حرارت مطلوبحرارت خشک
درجه مرطوبزمان (دقیقه)فشارزمان (دقیقه)
C1211515
126⁰C1020
134⁰C330
140⁰C180
150⁰C150
160⁰C120
170⁰C60

باسیلوس ها

Egg yolk reactionAnaerobic growthOptimum temp.for growth(⁰C)Pathogenicity for mouseSporeCapsuleMotilitySpecies classified by size of bacilli
a.Large celled 2-8×1-1.5μm
±+35HighC+B.anthracis
++30LowC+B. cereus
++30LowC+B. cereus var.mycoides
35LowC±+B.megaterium
b.Small celled,
1.5-5×0.5-0.8μm
37NoneC+B.subtilis
37NoneC+B.pumilis
+37NoneC+B.licheniformis
+35NoneC/ST+B.polymyxaa
±35NoneT+B.stearothermophilusa

صفات بیوشیمایی در جنس های مهم از خانواده انتروباکتریاسه

 .اندلMRVPسیتراتSH2اورهتحرکلیزین دکربوکسیلازفنیل  آلانین دزآمینازگازتخمیر لاکتوز
اشریشیا کولیمثبتمثبتمنفیمنفیمنفیمنفیمتغیرمثبتمنفیمثبتمثبت
شیگلامتغیرمثبتمنفیمنفیمنفیمنفیمنفیمنفیمنفیمثبتمنفی
سالمونلامنفیمثبتمنفیمتغیرمتغیرمنفیمثبتمثبتمنفیمتغیرمنفی
سیتروباکترمتغیرمثبتمنفیمثبتمتغیرمتغیرمتغیرمنفیمنفیمثبتمتغیر
کلبسیلامتغیرمتغیرمثبتمثبتمنفیمثبتمنفیمثبتمنفیمثبتمثبت
انتروباکترمنفیمنفیمثبتمثبتمنفیمتغیرمثبتمتغیرمنفیمثبتمثبت
سراشیامنفیمتغیرمتغیرمثبتمنفیمتغیرمتغیرمتغیرمنفیمتغیرمنفی
پروتئوسمتغیرمثبتمتغیرمتغیرمثبتمثبتمثبتمنفیمثبتمثبتمنفی
مورگانلامثبتمتغیرمنفیمنفیمنفیمثبتمتغیرمنفیمثبتمثبتمنفی
پروویدانسیامثبتمتغیرمنفیمثبتمنفیمتغیرمثبتمنفیمثبتمتغیرمنفی
یرسینیامتغیرمثبتمنفیمنفیمنفیمتغیرمنفیمنفیمنفیمنفیمنفی
ادواردسیلامثبتمتغیرمنفیمنفیمثبتمنفیمثبتمثبتمنفیمثبتمنفی
آریزونامنفیمثبتمنفیمثبتمثبتمنفیمثبتمثبتمنفیمثبتمثبت

مدت زمان انکوباسون محیط های کشت

محیط کشتزمان انکوباسیونارگانیسم های کنترلینتیجه قابل انتظار
بایل اسکولین آگار24 ساعتاسترپتوکوک فکالیس / پایوژنزرشد مثبت ، محیط سیاهرنگ می شود/ رشد منفی
بلاد آگار جار شمع دار co224 ساعتاسترپتوکوک پایوژنز/ پنومونیهرشد مثبت دارای همولیز بتا / آلفا
شکلات آگار24 ساعتهموفیلوس آنفولانزارشد مثبت
لایزین دکربوکسیلاز( محیط بوسیله روغن استریل پوشانده می شود )48 ساعتسالمونلا تایفی موریوم شیگلا فلکسنریمثبت ( بنفش رنگ می شود ) منفی (بدون تغییر رنگ)
اورنیتین ( دکربوکسیلاز)48 ساعتسالمونلا تایفی موریوم / کلبسیلا پنومونیهمثبت/ منفی
آرژینین ( دی هیدرولاز)48 ساعتسالمونلا تایفی موریوم / پروتئوس میرابیلیسمثبت / منفی
کلایگلر آیرون آگار24 ساعتسیتروباکتر فروندی سالمونلا تایفی موریوم شیگلا فلکسنری اسینتو باکتر کالکوستیکوسگاز+ A/A,SH2 گاز یا بدون گاز+ K/A,SH2 K/A تغییر نمی کند
مک کانکی آگار ( همراه با کریستال ویوله)24 ساعتاشرشیا کلی پروتئوس میرابیلیس استرپتوکوک فکالیسکلنی های قرمز رنگ کلنی های بیرنگ ، بدون سوارمینگ (خزش) رشد منفی
مانیتول سالت آگار24 ساعتاستافیلوکوک اورئوس استافیلوکوک اپیدرمیدیس اشرشیا کلیکلنی های زرد رنگ کلنی های قرمز رنگ رشد منفی
MRVP48ساعتاشرشیا کلی کلبسیلا پنومونیهMR مثبت – VP منفی MR منفی – VP مثبت
مولر هینتون آگار24 ساعتاستافیلوکوک اورئوس سودوموناس آئروژینوزا اشرشیاکولیبه جدول میزان هاله عدم رشد قابل قبول در بخش آنتی بیوگرام مراجعه شود
فنیل آلانین دآمیناز24 ساعتاشرشیا کلی / پروتئوس میرابیلیسمنفی / مثبت
سالمونلا شیگلا آگار (S.S) یا دزوکسی کلات سیترات آگار24 ساعتاشرشیا کلی/ سالمونلا تایفی موریوم یرسینیا انتروکولیتیکا / شیگلا فلکسنریمنفی / کلنی های بیرنگ کلنی های بیرنگ / کلنی های بیرنگ
سلنیت برات (SF)24 ساعتسالمونلا تایفی موریوم اشرشیا کلیبعداز کشت مجدد رشد می کند بعد از کشت مجدد رشد نمی کند
سیمون سیترات ( در لوله های با درپیچ شل در انکوباتور گذاشته شود)24 ساعتاشرشیاکولیرشد منفی
TSI عمق محیط باید 3 سانتی متر باشد ( با درپیچ شل اتوو گذاری شود )24 ساعتسیتروباکتر فروندی سالمونلا تایفی موریوم شیگلا فلکسنری اسینتوباکتر کالکوستیکوسگاز+ A/A,SH2 گاز یا بدون گاز+ K/A,SH2 K/A تغییر نمی کند
محیط اوره24 ساعتاشرشیاکولی / پروتئوس میرابیلیسمنفی / مثبت ، صورتی  

موارد بحراني در آزمايشگاه ميكرب شناسي

تعريف:

موارد بحراني در آزمايشگاه ميكرب شناسي، شامل نتايج آزمايش هايي است كه مي توانند تهديد كننده حيات بيمار باشند و بايد فورا” و از هر طريق ممكن به اطلاع پزشك معالج برسد. اين موارد شامل يافته هاي مرتبط با ارگان هاي درگير، تشخيص ميكروارگانيسم ها و بعضي از مقاومت هاي ميكربي است كه از نظر باليني مهم هستند و نياز به اطلاع رساني فوري آزمايشگاه دارد، به نحوي كه اقدام سريع پزشك معالج، پرسنل بيمارستان و يا گزارش به مراجع مسئول را طلب مي كند.

وظايف آزمايشگاه:

  1. كليه آزمايشگاه هاي بيمارستاني و غير بيمارستاني موظف هستند نتايج بحراني را فورا” به طور شفاهي و به شيوه مناسب و از هر طريق ممكن به اطلاع پزشك معالج يا پرسنل درماني برسانند.
  2. آزمايشگاه موظف است فردي را به عنوان تأييد كننده و گزارش دهنده نتايج بحراني مشخص نمايد.
  3. تمام مراحل فرايند اطلاع رساني بايد با ذكر جزئيات، مستند و نگهداري شود. براي مثال: نام فرد گزارش دهنده، نام فرد تأييد كننده و مسئول، نحوه تماس، ساعت و تاريخ تماس، شماره تماس، مشخصات فردي كه با او تماس گرفته شده است و ….
  4. اگر كليه تلاش هاي منطقي و قابل قبول براي تماس با پزشك يا يكي از كادر درماني بيمار ناموفق بود، تمام مراحل انجام شده بايد توسط آزمايشگاه به صورت مكتوب نگهداري شود.
  5. به دنبال گزارش شفاهي، لازم است نتيجه آزمايش اوليه به صورت كتبي نيز گزارش شود.
  6. گزارش نهايي موارد بحراني، بعد از تكميل مراحل آزمايش بايد به صورت كتبي به اطلاع پزشك يا پرسنل درماني رسانده شود.

توضيح:

  1. تلاش شده است مجموعه پيوست، به صورت جامع و براي تمام آزمايش هاي ميكرب شناسي تهيه گردد. بديهي است آزمايشگاه هر مركز با توجه به سطح و نوع آزمايش هايي كه انجام مي دهد، مي تواند از بخش هاي مختلف اين مجموعه استفاده نمايد.
  2. مجموعه پيوست شامل موارد بحراني در بخش هاي ذيل مي باشد:
  3. باكتري شناسي: اسمير، كشت، آزمايش هاي آنتي ژني و سرولوژي، سنجش توكسين و روش هاي مولكولي
  4. قارچ شناسي: اسمير، كشت و آزمايش هاي آنتي ژني
  5. انگل شناسي: اسمير، كشت، آزمايش هاي آنتي ژني و سرولوژي، و روش هاي مولكولي
  6. ويروس شناسي: كشت و روش هاي مولكولي
  7. ساير آزمايش هاي مرتبط با بخش ميكرب شناسي

جدول 1- موارد بحراني در آزمايشگاه ميكرب شناسي- آزمايش هاي باكتري شناسي

ملاحظاتنتايج بحرانيسنآزمايش
 هر نتيجه مثبتتمام گروه هاي سنيكشت خوناسمير (رنگ آميزي گرم )
 هر نتيجه مثبتتمام گروه هاي سنيمايع مغزي نخاعي (CSF)
اولين تشخيص باكتري در رنگ آميزي گرم بحراني تلقي مي شود. در صورت مثبت شدن مجدد طي يك هفته، اين نتيجه ديگر بحراني تلقي نمي گردد.هر نتيجه مثبتتمام گروه هاي سنيمايعات استريل بدن شامل: جنب، آسيت، مفصل، زجاجيه، پريكارد و …
 هر نتيجه مثبت يا منفيتمام گروه هاي سنينمونه هاي بخش جراحي مانند آبسه هاي مغزي و مايعاتي كه در حين جراحي برداشته مي شوند
ملاحظاتنتايج بحرانيسنآزمايش
 >45  µg/mlتمام گروه هاي سنيوانكومايسين
 >35  µg/mlتمام گروه هاي سنيآميكاسين
 >20  µg/mlتمام گروه هاي سنيجنتامايسين
 >10  ng/mlتمام گروه هاي سنيتست پروكلسيتونين
ملاحظاتنتايج بحرانيسنآزمايش
 نتيجه مثبتتمام گروه هاي سنيسودوموناس در نمونه چشمكشت
هر نمونه اينتيجه مثبتتمام گروه هاي سنيگونه هاي بروسلا
هر نمونه اينتيجه مثبتتمام گروه هاي سنيباسيلوس آنتراسيس
هر نمونه اينتيجه مثبتتمام گروه هاي سنيفرانسيسلا تولارنسيس
هر نمونه اينتيجه مثبتتمام گروه هاي سنييرسينيا پستيس
 نتيجه مثبتتمام گروه هاي سنياسترپتوكك گروه A جدا شده از فاسيت و يا زخم هاي جراحي
 نتيجه مثبتتمام گروه هاي سنيلژيونلا
 نتيجه مثبتتمام گروه هاي سنيلپتوسپيرا
زنان باردار و افراد مبتلا به هر گونه نقص سيستم ايمنينتيجه مثبتتمام گروه هاي سنيليستريا
در صورتي كه از نمونه مجدد بيمار طي دو هفته دوباره باكتري جدا شود، ديگر به گزارش شفاهي يا فوري نيازي نيست.اولين بار جداسازي و جداسازي سويه هاي مقاوم (MDR و XDR)تمام گروه هاي سنيكشت مثبت مايكوباكتريوم توبركولوزيس
هر نمونه اياولين جواب مثبتتمام گروه هاي سنيساير گونه هاي مايكوباكتريوم
 نتيجه مثبتتمام گروه هاي سنيكورينه باكتريوم ديفتريه
 نتيجه مثبتزنان باردار  هفته 37-35 باردارياسترپتوكوكوس آگالاكتيه در نمونه هاي ادرار، تناسلي و ركتوم در زنان باردار
 نتيجه مثبتتمام گروه هاي سنيسودوموناس آئروژينوزا يا گونه هاي باسيلوس در نمونه ترشحات چشم
 نتيجه مثبتتمام گروه هاي سنيبردتلا پرتوسيس
اين مقاومت ها با نظر كميته كنترل عفونت مي تواند در بخش هاي مختلف بيمارستان به عنوان موارد بحراني در نظر گرفته شود.نتايج مثبتتمام گروه هاي سنيارگانيسم هايي با مقاومت ميكربي چندگانه، مانند MRSA، MRS، ESBLs، مقاومت به كارباپنم ها، مقاومت VRSA، VISA، VRE، پنوموكك مقاوم به پني سيلين و هر گونه مقاومت غير منتظره
ملاحظاتنتايج بحرانيسنآزمايش
 هر نتيجه مثبتتمام گروه هاي سنيكشت خونكشت
 هر نتيجه مثبتتمام گروه هاي سنيمايع مغزي نخاعي (CSF)
اولين تشخيص باكتري در كشت بحراني تلقي مي شود. در صورت مثبت شدن مجدد طي يك هفته، اين نتيجه ديگر بحراني تلقي نمي گردد.هر نتيجه مثبتتمام گروه هاي سنيمايعات استريل بدن شامل: جنب، آسيت، آمنيوتيك، مفصل، زجاجيه، پريكارد و …
 نتيجه مثبت براي ويبريو كلراتمام گروه هاي سنيمدفوع
 نتيجه مثبت براي E. coli Enterohemorrhagic مانند E. coli O157كمتر از 18 سال
در بيماران بسترينتيجه مثبت براي شيگلاكمتر از 12 سال
در بيماران بستري و سرپايينتيجه مثبت براي شيگلا ديسانتريهتمام گروه هاي سني
در صورت وجود خون يا گلبول سفيد درنمونه بيمارنتيجه مثبت براي كمپيلوباكتراطفال
در بيماران بستري و سرپايينتيجه مثبت براي سالمونلا تايفيتمام گروه هاي سني
بيماران با علائم باليني شديد يا داراي نقص سيستم ايمنينتيجه مثبت براي سالمونلاهاي غير تايفيتمام گروه هاي سني
 هر نتيجه مثبتتمام گروه هاي سنيمايع دياليز
 نتيجه مثبتتمام گروه هاي سنينيسريا مننژيتيديس در نمونه هاي مايع مغزي نخاعي، خون، مايع مفصل و پتشي

منابع :

clinical diagnosis  & management by laboratory method:j.b.Henry 2007

Urinalysis&body fluid S.KStrasinger,2001                                                     

0 پاسخ به "دستورالعمل بخش میکروب شناسی"

ارسال یک پیغام

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد.

درباره

گروه فن آور دی مِیک با سابقه ده ساله در حوزه مدیریت و فن آوری اطلاعات از سال 1397 با تشکیل مجموعه شرکت های دانش بنیان مستقر در پارک علم و فن آوری، فعالیت خود را آغاز کرد. ما بر آنیم تا با ارائه خدمات ویژه به جامعه پزشکی و آزمایشگاهی کشور و بهره گیری از افراد متخصص و خلاق در زمینه های مختلف، خدمات جامع و کاملی را با بهترین کیفیت و بهترین قیمت به مشتریان خود ارئه کنیم .

آکادمی

 

تماس

  • تلفن: (021) 91312424
  • واحد فروش: 09021110087
مرکز انفورماتیک گروه فن آور دی مِیک 2020
X