• هیچ محصولی در سبد خرید نیست.

دستور العمل كنترل كيفيت در آزمايشگاه تشخیص طبی

1-  هدف: هدف از تهیه این دستورالعمل  آشنایی با روشهای کنترل کیفیت در بخش های مختلف و عمومی  آزمایشگاه تشخیص طبی  میباشد.  
2- دامنه کاربرد : دامنه این روش ، آزمایشگاه تشخیص طبی می باشد.  
3- تعاريف : سایر واژه گان، بصورت تخصصی می باشد.        
 4مسئولیت : مسئول اجرای این دستورالعمل مسئولین کلیه بخشها و مسئول کنترل کیفیت آزمایشگاه می باشد.   مسئولیت  نظارت بر حسن اجرای این روش بر عهده نماینده مدیریت، سوپر وایزر و مدیر فنی آزمایشگاه می باشد.
5– مدارك مرتبط: روش اجرایی کنترل مدارک وسوابق روش اجرایی محصول نامطبق روش اجرایی اقدامات اصلاحی و پیشگیرانه روش اجرایی کنترل کیفیت  

مقدمه ای بر تضمین کیفیت

 در يك آزمايشگاه باليني بايد نتايج آزمايشها درست باشد ، آزمايشهايي كه به منظور مطالعه اپيدميولوژيكي و غربالگري انجام مي گيرند قابل اعتماد باشد ، آزمايشگاه باشد به طور موثر و كارآ با حداقل هزينه و حداكثر استاندارد كار كند.

براي بدست آوردن چنين آزمايشگاهي بايد نظارت دقيق همراه با يك برنامه تضمين كيفيت داشت. تضمين كيفيت تمام جنبه هاي آزمايشگاه را در بر مي گيرد در واقع از نمونه گيري تا ارسال نتيجه آزمايش را مد نظر دارد. به طور اختصار شامل كنترل كيفي داخلي ، كنترل كيفي خارجي ، بررسي مهارت و استاندارد سازي است. به طور خلاصه مي توان گفت كنترل كيفي داخلي اساساً براي بررسي دقت و تكرار پذيري نتايج آزمايشگاه بوده و كنترل كيفي خارجي با مقايسه بين آزمايشگاه ها ايجاد يكنواختي و صحت بالا در نتايج آزمايشها مي نمايد. كنترل كيفي خارجي كمكي است كه بتوانيم نتايج صحيح براي آزمايشها بدست آوريم.

تضمین کیفـیت شامل مجموعه تلاشهایی است که برای بهبـودی کارآیی وموثـر بودن آزمایشگاه انجام می شود تا یک روند آزمایش از کیفیت قابل قبـولی برخوردار شود . به زبان دیگر اعمال سیسـتم کارآمد جهت شناسـائی ، جلوگیری و اصـلاح خطاهای انجام شده از زمان درخواست آزمایش تا خروج جوابـها از آزمایشگاه می باشد .

  • عملکرد آزمایشگاه در طی پروسس تائید اعتبار ( واقعی بودن و دقت )

و تعییـن صحـت اندازه گیریها و مشـاهدات (سیستم اندازه گیری) و همینطور در دسترس بودن و جایگزینی آنها مشخص می شود.

  • کنترل کیفیت روشی برای کنترل پایداری (ثبات) سیستم اندازه گیری میباشد . این کار توسـط روشهای کنتـرل کیـفی داخلـی با استفاده از یکسری مواد کنتـرل مناسب و قوانین کنترل انجام می شود.
  • کنترل کیفی خارجی و مقایسه های بین آزمایشـگاهی وسیله دیگری برای اطمیـنان از پایداری کلیه سیسـتمهای اندازه گیری می باشد .
  • به علاوه طرحهای ارزیابی کیفی خارجی ،ارزش آموزشی نیز دارد.

اهداف کنترل کیفیت

  • کنترل کیفیت به معـنای مطالعه خطاهایی است که آزمایشـگاه مسئول آنها می باشد و شناخت روشهای مناسب برای کاهش این خطاها وحصـول اطمینان از صحـت و دقـت لازم جوابهای گزارش شده می باشد.
  • چون کیفیت جوابها در تصمیم گیری پزشک موثر است ، باید آزمایشگاه به حداقل کیفیت لازم دست یابد.
  • اهـداف برنامه کنـتـرل کیـفـی در هـر آزمایـشـگاه با توجه به امکانات و حدود وظایف آن آزمایشگاه تعیین می شود . پس از تعیین اهداف ، روشهای موثر برای بهبود کیفیت تعیین و اجرا می شوند.
  • کیفیت به طور مطلق قابل دسترسی نمی باشد.
  • در هـر آزمایشـگاه بسته به خـصوصـیات ، تسـهیلات ، نـوع بیماران و نظر پزشکان همکار وقیمت مواد و روشهای بکار رفته در کنترل کیفی ،اهداف کیفی تعیین می شوند.

خطای مجاز آزمایشگاهی  Allowable Error

  • خطای سیستمیک Systemic Error

خطاهایی است که باعث ایجاد تغییر در یک سمت (کاهش یا افزایش نتایج) میشوند. که یا ذاتی

( Natural) است یا توسط پرسنل (Man made) به وجود می آید.

انواع خطاهای سیستمیک :

  • Aging:مواد شیمیایی و رآجنتها در طی نگهداری  دچار تغییر در ترکیب و غلظت می شوند ممکن است کریستالیزه شده یا مورد حمله باکتریها یا قارچها قرار بگیرند ، اثر لوازم شیشه ای و پلاستیکی در رآجنتها و نمونه ها بایستی بررسی شود.در اثر ماندن ممکن است ناخالصیها از هوا جذب شوند.
  • Personnel bias : وارد کردن نادانسته خطا در نتایج یا خواندن اشتباه OD یا وارد کردن عدد اشتباه به دستگاه و…
  • Laboratory bias : تغییرات در استانداردها ،رآجنتها،محیط کار ،متد و دستگاه
  • Inter &Intra individual bias: تغییرات بین افراد مثل نژاد ، سن ، جنس، حالت سلامت و… یا تغییرات در یک فرد مثل ساعت به ساعت ، روز به روز ، فصلی ، ماهیانه ، پریود و بارداری و…
  • Experimental Error: تفاوت و تغییر در گروههای مورد اندازه گیری و …

اگر از ماده ای با غلظت و کیفیت معلوم رقتهای متوالی تهیه شده و

آزمایش شده چارت مقابل بدست آید یعنی روش صحیح وعالی است.

در Error Proportional نتایج بالاتر یا پایینتراز حد مورد انتظاراست

وهرچه غلظت ماده مورد نظر بیشتر باشد، خطا بیشتر می شود.

برای هرتست و روش بایستی این چارت در فواصل مناسب رسم شود و

بر اساس نوع بایاس و مقدار آن در تصحیح آن اقدام نمود.  مثلا درنوع

ثابت می توان عدد ثابتی را از نتایج کم کرده یا بدان اضافه نمود.بنابراین

خطای سیستمیک قابل تصحیح است. مثل سمپلر۱۰۰که ۹۵ میکشد.

  • خطای اتفاقی    Random Error

علاوه بر خطای سیستمیک تستها دچار خطای رندوم نیز می شوند.

  • خطاهای رندوم،خطاهایی هستند که علت آنها مشخص نبوده و تحت کنترل

نمی باشد،این خطاها شانسی و تصادفی بوده و ممکن است در هر جهتی باشد. شانس ایجاد خطای تصادفی نسبت مستقیم با عوامل زیر دارد:

  • کیفیت رآجنتها
  • تعداد مراحل و پیچیدگی تست
  • مهارت تکنسین
  • کیفیت وسایل
  • عدم تو

عدم دقت یا Random variability ,Imprecision 

در نوع خطای نسبی رندوم حد تغییر به طور متناسب

با غلظت ،زیاد یا کم می شود مثل رادیو ایزوتوپ RIA

که دارای مقدار تشعشع متغیر است.

در نوع خطای ثابت رندوم حد تغییر ثابت است و ربطی

به غلظت ندارد همانند کدورت نمونه یا رآجنتها

تصحیح کامل خطاهای اتفاقی غیر ممکن است.

خطای سیستمیک در خطای رندوم هم اثر می کند . در تستهایی که از استاندارد با کیفیت بالا استفاده میشود ، خطـای سیـستـمیک تا حدی قابل اغماض است . به خطـاهای رنـدوم باید هرچه سریـعتر رسیـدگی کرده و آنها را برطـرف کنیم . صحت در گرو دقت است ، اگر دقت وجود نداشته باشد ، صحت بدست نمی آید.

Bias یا انحراف از صحت یعنی اختلاف میانگین یکسری نتایج بدست آمده با نتیجه مورد انتظار

Accuracyیا صحت یعنی تطابق نتیجه حاصل از انجام یک آزمایش با مقدار واقعی آن(نتیجه یکبار تست)

شناخت نوع Bias(عدم صحت یا خطای سیستمیک) و خطای رندوم (عدم دقت) مشاهده شده

در هرتست و روش ما را قادر به شناسایی دلیل آنها و اصلاح آنها می کند.

در چارتهای Levey-Jenning خطای سیستمیک سبب Shift و Trend شده ولی خطای رندوم سبب افزایـش CV% و پراکندگی نتایج یا پهـن شـدن منحنی توزیع فراوانی و افزایش احتمال وقوع نتایج در خارج از محدوده می شود.

خطای کلی       Total Error

به منظور درک بهتر تاثیر خطاهای مختلف (صرف نظراز نوع آنها) در نتیجه آزمایش به مجموعه خطاهای سیستمیک و رندوم Total Error  اطلاق می شود که نشانگر کیفیت قابل دستیابی با یک متد آزمایشگاهی می باشد.

خطای کلی معمولا با فرمول زیرمحاسبه می شود.

Total Error =bias% +z CV%

که  z فاکتور ثابتی است (۶۵/۱ یا ۹۶/۱ )

به طور مثال اگر در اندازه گیری TG ،

CV%=3%وBias=4% باشد: TE=10%

یعنی اگر غلظت واقعی TG نمونه  ۱۵۰ باشد

نتیجه با این روش می تواند   ۱۶۵- ۱۳۵ باشد.

اولین گام در استقرار یک سیستم کیفی آزمایشگاهی ،تعیین اهداف کیفی یا Total Allowable Error است ،که نشان می دهد در صورت کار با یک متد خاص در شرایط مناسب ، با تکرار آزمایش چه میزانی از تغییرات در نتیجه آزمایش قابل قبول است. برای تعیین مقدار قابل قبول خطای مجاز از استراتژی های مختلف استفاده شده است:

  • استفاده از قسمتی از محدوده مرجع Reference Interval

در سال ۱۹۶۳ توسط Tonks مطرح شده ولی از آنجائیکه محدوده مرجع تحت تاثیر عوامل مختلفی مثل گروه مورد بررسی و روش آزمایشگاهی و غیره قرار دارد امروزه این استراتژی کمتر مورد استفاده قرار میگیرد.

Allowable Error = 2CV

  • نظریه کلینیسین ها: در اواسط دهه ۱۹۶۰ Barnett با استفاده از نظرسنجی از پزشکان خطای مجاز را تعیین نمود.
  • شرایط موجود : CLIA با استفاده از نتایج کنترل کیفی خارجی وعدم دقت و  Bias متدهای موجود برای تعیین خطای مجاز استفاده نمود. در این استراتژی CV آنالیتیک بایستی کمتر از ¼ محدوده مورد نظر CLIA باشد.
  • نظریه افراد و گروههای کارشناس:

در مورد برخی پارامترها ،گروه های کارشناس مقادیر CV و Bias مجاز را تعیین نمودند.

مثل مشخص نمودن خطای مجاز TG,Chol توسط  (NCEP) National Cholesterol Education Program

  • تغییرات بیولوژیک:در این روش تغییرات یک پارامتر در مدت زمانی مشخص ،در بدن یک فرد و افراد مختلف اندازه گیری و بر اساس آن ضریب انحراف درون فردی و بین فردی تعریف گردیده است.

که در سایت : WWW.Westgard.com\Biodatabase قابل دستیابی است.

آزمایشگاه بایستی از ابتدا مشخص کند برای هر پارامتر چه میزانی از  CVو Bias قابل قبول است و بر این اساس متد و کیت اندازه گیری را انتخاب نماید.

به طور مثال مشخصات کیفی مورد ادعای یک کیت اندازه گیری کلسترول به شرح زیراستCV%=4%,Bias=3%

  بنابراین TE = 11%که از خطای مجاز کلسترول که ۸/۹% است بیشتر است،لذا کیت فوق غیر قابل قبول است.

پس از انتخاب متد مورد استفاده ،بایستی روند کار را با استفاده ازچارتهای کنترل کیفی به طور مرتب

تحت نظر قرار داد .CV% حاصله در چارت کنترل کیفی را باید در مقایسه با خطای مجاز تایید نمود .

در انتخاب روشهای آماری با توجه به فواید و اشکالات هرروش،بسته به خصوصیات تستهای آماری بایستی

روش کنترلی انتخاب شود که (probability for False rejection)آن کم (PFR<5%)

و (Pedproabilityfor Error Detection)آن زیاد باشد و حداقل دو روش کنترل بکار

برید که یکی حساس به خطای سیستمیک و دیگری حساس به خطای رندوم باشد.

سهل ، ساده ، کم وقت گیر، کم هزینه،اتومیشن و نزدیک به Quality Goals باشد.

       روشهای تضمین کیفیت

  • Pre Analytical Variabilities

مانند تقاضای آزمایش ، آماده کردن بیمار،شناسائی بیمار،نمونه گیری، دستورالعمل برای پرستاران،انتقال نمونه ،نگهداری نمونه،معیارهای رد نمونه، امکانات فیزیکی مورد نیاز،

تجهیزات با کیفـیت و کالیبر، کادر آزمایشگاهی با کفایت، پردازش و آماده سازی وتقسـیم

نمونه ها ،تهیه لیست کار،کارهای دفتری و نگهداری و بایگانی توجه به مقررات ایمنی .

  • Analytical Variabilities

انتخاب متد و روش آزمایش استاندارد و کالیبره نمودن وکنتری کیفیت آزمایشها ،

ثبت روشها و دستور کارها ،کنترل تجهیزات ،معرفها ،رآجنتها و…

  • Post Analytical Variabilities

گزارش نتایج و وارد کردن صحیح و دقیق و به موقع وکامل جوابها در لیستهای کار

و کامپیوتر، چک وامضا ، مقادیر نرمال ، بایگانی جوابها، کنترل کیفیت آزمایش انجام

شده با روشهای آماری و چارتهای کنترل وضبط و بایگانی آنها،تحلیل و تفسیر نتایج

   معیارهای اصلی کنترل کیفیت بخشهای آزمایشگاهی

  • کنترل پرسنل
  • کنترل رآجنتها ،کیتها و

کل مواد مصرفی

  • کنترل کلیه تجهیزات ،دستگاهها

وسایل و ابزارها

  • کنترل روش کار

Standard Operating Procedures

     انواع تضمین کیفیت و کنترل عملکرد آزمایشگاه

  • تضمین کیفیت داخلی
  •  

Duplicate test Or Duplicate Random  یا آزمایش مضاعف

Check Test  یا آزمایش باز بینی

Replicate Test  یا آزمایشات تکراری و تعیین CV%

همخوانی نتایج (اوره با کراتینین و T4&TSHو…)

ارتباط بالینی (علائم کلینیکی،یافته های جراحی ،پاسخ به درمان ، اطلاعات اتوپسی و…)

Delta Check Or Delta Test  (پرونده بیمار در بخش یا حافظه کامپیوتر آزمایشگاه )

نمودار کنترل ( Lvey-jenningو (Cusum

Patient Mean Or Daily Mean   

روش نمونه مجهول یا (Intra laboratory Duplication)

کنترل دقت روزانه و کنترل صحت متناوب با مواد متفاوت

  • تضمین کیفیت خارجی

تهیه چک لیستها

کنترل کیفیت ناحیه ای،ملی و بین المللی

سنجش مهارت Proficiency Testing

1-5- كنترل كيفيت تجهيزات آزمايشگاهي :

ميكروپيپت / سمپلر

چگونگي كاربري

پس از محكم كردن نوك سمپلر مناسب به سمپلر ، ابتدا دكمه كنترل / فشار (Control button/ push button) سمپلر را به آرامي تا توقف اول دكمه ، پايين مي آوريم. در همان حال نوك سمپلر را چند ميليمتر (حدود 3 ميلي متر وبسته به حجم سمپلر) در مايع فرو برده و دكمه فشار را به آرامي رها مي كنيم تا مايع وارد نوك سمپلر شود ، براي تخليه در لوله يا ظرف مورد نظر ، با فشار مجدد دكمه تا توقف اول ، محلول را با تماس به جداره ظرف به آرامي خارج كرده و پس از 3-1 ثانيه با فشار تا توقف دوم ، باقيمانده محلول را نيز كاملاً خارج مي نمائيم.

جهت رسيدن به حداكثر دقت و صحت براي سمپلر هاي با حجم 10 ميكروليتر و بيشتر ، توصيه مي شود قبل از انتقال حجم نمونه ، 2 الي 3 بار عمل برداشت و تخليه از نمونه تكرار شده تا كاملاً جدار داخلي نوك سمپلر به نمونه آغشته شود و سپس حجم مورد نظر از نمونه منتقل شود.

براي حجم هاي كمتر از 10 ميكروليتر بهتر است ، فقط يكبار برداشت با نوك سمپلر Unwetted Tip كه خشك و بدون آغشتگي به نمونه باشد ، انجام شده و پس از تخليه در محل مورد نظر ، جهت اطمينان از تخليه كامل تمامي حجم درون نوك سمپلر ، با محلول موجود در ظرف شسته شود.

بايد در نظر داشت ، عملكرد مطلوب سمپلر فقط با استفاده از سر سمپلر هاي نو و يكبار مصرف بدست مي آيد و از شستشو و استفاده مجدد از سر سمپلر ها ، مي بايست خودداري نمود.

نكات مهمي كه در كار با سمپلر مي بايست رعايت شود ، عبارتند از :

1- اطمينان از اتصال كامل نوك سمپلر به سمپلر

2- عمود نگهداشتن سمپلر در زمان مكش

3- تخليه محلول با تماس نوك سمپلر به جداره ظرف تحت زاويه 10 تا 40 درجه

4- رها كردن آرام دكمه در زمان پر يا خالي كردن محتويات نوك سمپلر

5- كشيدن كناره هاي خارجي نوك سمپلر پس از انجام مكش به جداره هاي فوقاني لوله به منظور حذف قطرات خارجي نوك سمپلر يا در صورت نياز خشك كردن قطرات باقي مانده در بخش خارجي آن به كمك پارچه اي بدون پرز (البته بايد مطمئن شد كه پارچه چيزي از محتويات داخل نوك سمپلر به خود جذب نكند)

6- هنگام تخليه محلول پس از توقف اول (پائين آوردن دكمه كنترل تا مرحله اول) بايد كمي تامل كرد (3-1 ثانيه) و سپس دكمه را تا توقف دوم پائين آورد.

7- در سمپلر هاي متغير (قابل تنظيم براي حجم هاي مختلف) توصيه مي شود براي كاهش حجم و تنظيم حجم مورد نظر ، دكمه كنترل به آرامي تا رسيدن به حجم انتخابي ، چرخانده شود.

براي افزايش حجم بهتر است دكمه كنترل را تا كمي بيش از حجم مورد نظر پيچاند و بعد در خلاف جهت با كم كردن حجم به مقدار مورد نظر رسيد.

كنترل كيفيت سمپلر (ميكروپيپت) :

اطمينان از كاليبراسيون صحيح ميكرو پيپتها كه از طريق بررسي دقت و صحت عملكرد ميكرو پيپت در برداشت حجم مورد انتظار حاصل مي شود، نقش مهمي در برنامه هاي تضمين كيفيت ايفا مي كند. اگرچه اين ارزيابي به دو روش توزين و رنگ سنجي قابل انجام است، ولي تحت شرايط موجود و به علت عدم دسترسي اغلب آزمايشگاه ها به الزامات استفاده از روش توزين مانند تروازوهايي با درجه تفكيك (Resolution) مناسب براي كنترل سمپلر (درجه تفكيك 01/0 ميلي گرم) و كاليبراسيون منظم ترازو، استفاده از روش رنگ سنجي ، توصيه مي گردد.

بررسي دقت و صحت سمپلر بهتر است 3 تا 4 بار در سال انجام شود.

ارزيابي سمپلر (ميكروپيپت ) به روش رنگ سنجي :

در اين روش با استفاده از يك محلول رنگي با جذب پايدار ، مثل رنگ سبز خوراكي در طول موج 630- 620 نانومتر و يا پارانيترو فنل در طول موجهاي 401 يا 405 نانومتر ، صحت عملكرد سمپلر و نيز قابليت تكرار آن كنترل مي شود.

مواد و ابزار مورد نياز :

1- ماده رنگي :

*  رنگ سبز خوراكي

يا

*  پارانيترو فنل Paranitrophenol (C6H5NO3), indicator PH(5.4-7.5) MERCK Art. 6798  (جذب نوري بدست آمده از پودر پارانيتروفنل (انديكاتور) استفاده شده در اين دستور العمل با مقادير قيد شده براي Paranitrophenol High purity- NIST SRM 938  مندرج در كتاب Tietz 1999  قابل انطباق است.)

2- هيدروكسيد سديم 01/0 نرمال ، محلول كاري براي رقت سازي پارانيتروفنل.

Sodium hydroxide (NaOH), Pure . . . MERCK Art. 6462.

3- لوازم شيشه اي كلاس A با توجه به حجم مودر نياز در تهيه غلظت محلول رنگي (از قبيل بالن ژوژه و پيپت)

4- فتومتر داراي طول موجهاي 401 يا 405 براي پارانيتروفنل و 620 يا 630 نانومتر براي رنگ سبز خوراكي

5- لوله آزمايش

6- ترازو (كاليبره و تحت كنترل)

7- نوك سمپلر مناسب

8- آب مقطر

يادآوري 1 : طول موج انتخابي براي قرائت محلول پارارنيتروفنل 401 نانومتر است ولي امكان قرائت در 405 نانومتر نيز وجود دارد.

روش كار :

همانطور كه گفته شد انجام روش رنگ سنجي با استفاده از پودر رنگ سبز خوراكي و نيز با پارانيتروفنل امكان پذير مي باشد ، لذا نحوه تهيه هر دو محلول ذخيره (stock) ذيلا بيان شده است. قابل ذكر است در سالهاي اخير رنگ سبز خوراكي بعضا بصورت ناهمگون و يا محلول عرضه شده كه در اين موارد ، دستور العمل زير كاربرد نداشته بهتر است از پارانيتروفنل استفاده شود.

بطور معمول سمپلر ها به سه گروه 

الف) 1000-100 ميكروليتر ،

پ) حجم هاي كمتر از 10 ميكروليتر ، تقسيم مي شوند.

براي هر يك از گروه هاي فوق مي بايست بايد يك محلول ذخيره از رنگ تهيه نمود. از آنجايي كه اغلب فتومتر ها بهترين عملكرد خود را در محدوده جذبي 4/0 نشان مي دهند محلول هاي ذخيره رنگي با غلظتي تهيه مي شوند كه پس از مرحله رقيق شدن داراي جذبي در حدود 4/0 باشند.

1- طرز تهيه محلول رنگي ذخيره رنگ سبز خوراكي براي هر گروه از سمپلر ها :

سمپلر هاي گروه الف (1000- 100 ميكروليتر ) : 5/15 ميلي گرم پودر رنگ سبز در 100 ميلي ليتر آب مقطر حل شود. (غلظت رنگ در محلول ذخيره اين گروه ، 5/15 ميلي گرم درصد است)

سمپلر هاي گروه ب (100-10 ميكروليتر) : 155 ميلي گرم پودر رنگ سبز در 100 ميلي ليتر آب مقطر حل شود. (غلظت رنگ در محلول ذخيره اين گروه ، 155 ميلي گرم درصد است)

سمپلر هاي گروه پ (سمپلر هاي كمتر از 10 ميكروليتر) : 55/1 گرم از پودر رنگ سبز در 100 ميلي ليتر آب حل شود. (غلظت رنگ در محلول ذخيره اين گروه 55/1 گرم درصد يا 1550 ميليگرم درصد است)

2- طرز تهيه محلول رنگي ذخيره پارانيتروفنل براي هر گروه از سمپلر ها :

سمپلر هاي گروه الف (1000- 100 ميكروليتر ) : 42 ميلي گرم پودر پارانيتروفنل ، در يك ليتر آب مقطر ، حل مي شود. (غلظت رنگ در محلول ذخيره اين گروه ، 42 ميلي گرم در ليتر است)

سمپلر هاي گروه ب (100 تا 10 ميكروليتر) : 42 ميلي گرم پودر پارانيتروفنل ، در 100 ميلي ليتر آب مقطر ، حل مي شود. (غلظت رنگ در محلول ذخيره اين گروه ، 42 ميلي گرم درصد است)

سمپلر هاي گروه پ (سمپلر هاي كمتر از 10 ميكروليتر) : 420 ميلي گرم پودر پارانيتروفنل ، در 100 ميلي ليتر آب مقطر ، حل مي شود. (غلظت رنگ ذخيره اين گروه ، 420 ميلي گرم درصد است).

ارزيابي دقت

براي بررسي دقت عملكرد سمپلر و بعبارتي سنجش مقدار عدم دقت يا قابليت تكرار ، ابتدا محلول ذخيره رنگي مناسب طبق روش ذكر شده و با توجه به حجم سمپلر مورد كنترل ، تهيه مي گردد سپس ده لوله در جا لوله اي چيده و با استفاده از پي پت كلاس A و بر مبناي جدول (1-1) مقدار مشخص آب مقطر (در صورت استفاده از رنگ سبز) و يا سود 01/0 نرمال (در صورت استفاده از پارانيتروفنل) ، با دقت بسيار زياد در هر لوله ريخته مي شود.

سپس با استفاده از سمپلر مورد كنترل ، از محلول ذخيره رنگي برداشت شده و به هر لوله اضافه مي شود. پس از مخلوط كردن ، ميزان جذب نوري لوله ها در مقابل بلانك مناسب (آب مقطر براي سبز خوراكي و سود براي پارانيتروفنل ) قرائت مي گردد. همانطور كه قبلاً ذكر شد طول موج انتخابي براي قرائت جذب نوري رنگ سبز خوراكي 620 يا 630 نانومتر و براي پارانيتروفنل 401 يا 405 نانومتر مي باشد.

توجه : در صورت استفاده از محلول ذخيره پارانيتروفنل ، رقتهاي مورد نياز طبق جدول 1 مي بايد در سود 01/0 نرمال تهيه شود. در حاليكه براي رنگ سبز خوراكي از آب مقطر استفاده مي شود.

جدول (1-1)

گروه سمپلرحجم سمپلر مورد كنترل بر حسب ميكروليترآب مقطر يا سود 01/0 نرمال برداشتي توسط پي پت بر حسب ميلي ليترحجم رنگ برداشتي از محلول ذخيره توسط سمپلر بر حسب ميكروليتررقت حاصله
گروه پ5551001/1
گروه ب10110101/1
گروه ب20220101/1
گروه ب255/225101/1
گروه ب50550101/1
گروه ب10010100101/1
گروه الف200220011/1
گروه الف500550011/1
گروه الف100010100011/1

سپس ميانگين و انحراف معيار خوانده هاي جذب نوري (OD) 10 لوله، محاسبه و ضريب انحراف خوانده ها (CV%) بدست مي آيد.

CV : ضريب انحراف (Coefficient of variation)                           

SD : انحراف معيار

n : تعداد خوانده ها

  جذب نوري هر لوله

در صورت انتقال صحيح حجم آب و يا سود ، اختلاف در جذب نوري لوله هاي حاوي محلول رنگي به اختلاف در حجم برداشت شده توسط سمپلر ، نسبت داده شده و درصد ضريب انحراف خوانده ها معرف قابليت تكرار پذيري و مقدار عدم دقت سمپلر خواهد بود.

ارزيابي صحت

جهت كنترل صحت عملكرد سمپلر و تهيه معيار سنجش صحت در روش رنگ سنجي، بايد با استفاده از ابزار شيشه اي كاليبره ، محلولي داراي رقت مشابه با رقت تهيه شده توسط سمپلر تهيه شود. (1001/1 ) يا (101/1) و يا (11/1)

بدين منظور با پي پت كلاس A ، مقداري از محلول رنگي ذخيره (متناسب با گروه حجمي سمپلر و طبق روش ذيل) ، به بالن ژوژه كلاس Aاي كه تا خط نشانه از آب مقطر پر شده اضافه مي شود.

روش تهيه محلول هاي كنترل صحت :

كنترل صحت گروه پ (سمپلر هاي كمتر از 10 ميكروليتر) رقت 1001/1 :

بالن ژوژه يك ليتري را براي سبز خوراكي با آب مقطر و براي پارانيتروفنل با سود 01/0 نرمال به حجم رسانده سپس با پي پت كلاس A ، 1 ميلي ليتر از رنگ ذخيره (گروه پ) به آن اضافه و مخلوط نمايئد.

كنترل صحت گروه ب (سمپلر هاي 10-100) رقت 101/1 :

بالن ژوژه 100 ميلي ليتري را براي سبز خوراكي با آب مقطر و براي پارانيتروفنل با سود 01/0 نرمال به حجم رسانده سپس با پي پت كلاس A، 1 ميلي ليتر از رنگ ذخيره (گروه ب) به آن اضافه و مخلوط نمائيد.

كنترل صحت گروه الف (سمپلر هاي 100-1000) رقت 11/1 :

بالن ژوژه 100 ميلي ليتري را براي سبز خوراكي با آب مقطر و براي پارانيتروفنل با سود 01/0 نرمال به حجم رسانده سپس با پي پت كلاس A ، 10 ميلي ليتر از رنگ ذخيره (گروه الف) به آن اضافه و مخلوط نمائيد.

يادآوري 2 :

هر گاه براي اضافه كردن 10 ميلي ليتر رنگ ، در بالاي خط نشانه فضاي خالي وجود نداشت ، تا جائيكه امكان دارد از حجم 10 ميلي ليتر به بالن اضافه نموده و بقيه را به داخل بشر منتقل مي كنيم. پس از مخلوط نمودن كامل محتويات بالن ژوژه ، همه حجم را به بشر اضافه نموده و با محتويات بشر ، بالن ژوژه را چند بار شستشو مي دهيم.

پس از اطمينان از يكنواختي محلول صحت تهيه شده ، محلول حداقل در سه لوله ريخته و جذب نوري هر سه لوله قرائت مي شود. ميانگين خوانده ها بعنوان معيار مقايسه صحت عملكرد سمپلر استفاده مي شود.

شاخصه صحت ‌(Bias) است كه فرمول زير بدست مي آيد :

expected : ميانگين جذب نوري 3 خوانده از محلول تهيه شده در بالن ژوژه

observed : ميانگين جذب نوري 10 لوله كه در مرحله ارزيابي عدم دقت بدست آمده است.

يادآوري 3 : به منظور به حداقل رساندن عوامل ايجاد خطا بهتر است بررسي دقت و صحت در يك روز انجام گيرد.

مقادير مجاز عدم دقت و عدم صحت :

اولين معيار مقايسه براي كنترل سمپلر ها ، ميزان ادعا شده توسط سازندگان سمپلر براي Inaccuracy (Bias) و Imprecision (CV%) مي باشد. چرا كه به دنبال ارتقاي فن آوري ابزار آزمايشگاهي و بهبود كيفيت عملكرد ابزار ، مقادير عدم صحت و عدم دقت ادعائي سازندگان ميكروپيپتها نيز بسيار كاهش يافته است.

با توجه به مختصات كيفي بسياري از ميكرو پيپتها ، حداكثر ميزان قابل قبول عدم دقت  و حداكثر ميزان قابل قبول عدم صحت  پيشنهاد مي شود.

يادآوري 4 : معيار هاي ياد شده كه با توجه به تنوع سمپلر هاي مورد استفاده ازمايشگاه ها انتخاب شده است. اگر چه از معيار هاي مجاز اعلام شده قبلي كوچكتر مي باشد ولي هنوز با ميزان قابل قبول برخي مراجع بين المللي فاصله زيادي دارد.

تنظيم

در برخي از انواع سمپلر ها كه حجم ثابتي را برداشت مي نمايند (سمپلر هاFixed Volume)

در صورت وجود Bias غير قابل قبول ، مي توان با استفاده از اطلاعات مندرج در راهنماي سمپلر ، حجم برداشتي را تصحيح نمود.

در مورد تنظيم سمپلر هاي متغير بايد توجه داشت كه هر گونه تغيير در حجم هاي مختلف ، به ميزان ثابت اعمال مي شود. بدين معني كه تغيير 1 ميكروليتر در حجم 100 ميكروليتر (1% تغيير) در حجم 10 ميكروليتر نيز باعث 1 ميكروليتر تغيير ، (يعني 10% تغيير) خواهد شد. لذا بهتر است عمل تنظيم كاليبراسيون توسط شركت معتبر انجام شود.

نحوه نگهداري سمپلر : نگهداري سمپلر بر اساس دستور العمل سازنده انجام مي پذيرد ولي مطالب ذيل در مورد بيشتر انواع سمپلر صادق مي باشد.

  • كليه قسمت هاي خارجي اغلب سمپلر ها را مي توان با محلول صابون تميز كرد و پس از آبكشي با آب مقطر در دماي اتاق خشك نمود.
  • براي ضد عفوني كردن ، محلول 60% ايزوپروپانول توصيه مي شود. برخي از انواع سمپلر نيز قابل اتوكلاو هستند.
  • پس از شستشوي سطوح خارجي و تميز كردن بخش نگهدارنده نوك سمپلر “Tip holder”  (كه به كمك ميله همراه يا با سوآب آغشته به اتانل 70 درجه انجام مي گيرد) بايد پيستون با مقدار كمي از روغن همراه سمپلر ، كه اغلب Silicone grease مي باشد، روغن كاري شود.
  • براي تميز كردن قسمت هاي داخلي سمپلر بايد به راهنماي همراه سمپلر مراجعه شود.

نكات مهم :

1- ضربه به سمپلر مي تواند اين وسيله را از كاليبراسيون خارج نمايد.

2- با انتخاب سر سمپلر مناسب ، حجم محلول برداشتي بايد در حدي كه مايع وارد قسمت هاي داخلي نگردد.

3- تماس دست با نوك سمپلر آلوده ممنوع است.

4- در صورت مكش محلول هاي اسيدي و ساير مواد با خاصيت خورندگي بايد بخش نگهدارنده نوك سمپلر (Tip- holder) باز شده و پيستون و حلقه پلاستيكي (O-ring) بخوبي با آب مقطر شسته شود.

5- هرگز نبايد سمپلر حاوي محلول به پهلو روي ميز گذاشته شود.

6- هرگز نبايد سمپلر هاي متغير را بر روي حجمي خارج از محدوده حجم ادعائي آن تنظيم كرد.

اسپكتروفتومتر و فتومتر

مهمترين مواردي كه در اسپكتروفتومتر ها مورد ارزيابي قرار مي گيرند عبارتند از خطي بودن ، صحت فتومتريك ، صحت طول موج ، رانش و نور هاي ناخواسته

1- خطي بودن Linearity

هدف از اين آزمون تعيين محدوده اي است كه در آن ارتباط خطي بين نور جذب شده و خوانش فتومتر وجود دارد. در اين آزمايش ميزان عدم صحت جذب نوري در هر رقت بررسي مي شود.

براي اين ارزيابي از محلول هاي مختلفي مي توان استفاده نمود كه مي بايست تا حد امكان پايدار باشند بعلت تاثير متغير هايي از قبيل خطاي رقت، كاهش پايداري ، تغييرات pH و تاثيرات دما در محلولها، بايد در استفاده از اين روش ، عوامل ياد شده را تحت كنترل گرفت.

در صورت امكان ، استفاده از فيلتر هاي شيشه اي solid glass filter مانند ديدميوم، جايگزيني براي روش قبل مي باشد (اين فيلتر ها از طريق شركتهاي پشتيبان قابل دستيابي است)

بررسي خطي بودن با استفاده از محلول در طول موجهاي مختلف :

براي بررسي خطي بودن در طول موج 540 نانومتر از محلول HICN ، در طول موج 405 نانومتر از محلول پارانيتروفنل 08/0 ميلي مول در ليتر و در طول موج 340 نانومتر از محلول دي كرومات پتاسيم استفاده مي گردد.

جهت بررسي خطي بودن در طول موج 540 نانومتر:

مي بايست با مخلوط نمودن خون با درابكين، ذخيره اي (Stock) از محلول سيان مت هموگلوبين با جذب نوري حدود 2 تهيه شود. (بطور مثال از اضافه كردن 100 ميكروليتر خون با هموگلوبين 170 به 5 ميلي ليتر درابكين ، محلولي با جذب نوري حدود 09/2 بدست مي آيد). اگر ميزان هموگلوبين نمونه كم باشد حجم بيشتري از خون ، مي بايست به درابكين اضافه شود. سپس از اين محلول ذخيره ، حداقل 4 رقت تهيه مي شود (بطور مثال 2/1، 4/1 ، 8/1 و 16/1) و جذب نوري محلول ذخيره و رقتهاي تهيه شده در طول موج ياد شده در مقابل بلانك درابكين ، قرائت مي گردد تا 5 خوانده بدست آيد. جذبهاي نوري قرائت شده به عنوان مقدار مشاهده شده (observed) در نظر گرفته مي شود.

براي محاسبه ميزان خطا در هر رقت ، جذب نوري (OD) رقتي از محلول كه در حدود 4/0 باشد به عنوان مبنا انتخاب و ميزان خطاي ساير رقتها با توجه به آن محاسبه مي شود تا جذب مورد انتظار بدست بيايد.

بطور مثال اگرجذب نوري نمونه با رقت 4/1 ، حدود 4/0 باشد جذب نوري مورد انتظار براي رقت 2/1 بصورت زير محاسبه مي شود :

جذب نوري            رقت

4/0                       4/1

x                             2/1

مقدار x به دست آمده ، مقدار مورد انتظار (Expected) جذب نوري نمونه در رقت 2/1 مي باشد. بدين ترتيب پس از محاسبه جذب نوري مورد انتظار براي رقتهاي مختلف ، ميزان عدم صحت هر رقت با استفاده از فرمول Bias تعيين مي گردد.


مثال زير ، ميزان عدم صحت جذب نوري رقتهاي مختلف نمونه سيان مت هموگلوبين در يك دستگاه فتومتر را نشان مي دهد.

جدول 2-1

% Bias(OD observed) جذب نوري بدست آمده(OD expected) جذب مورد انتظار
91/0094/2075/2
18/0663/166/1
12/1259/1245/1
97/1017/1037/1
48/0826/083/0
415/0
1/2212/0207/0

براي بررسي خطي بودن در طول موج 405 نانومتر از محلول پارانيتروفنل 08/0 ميلي مول در ليتر استفاده مي گردد. طرز تهيه اين محلول :

وزن يك مول پارارنيتروفنل = 11/139 گرم

يك ميلي مول = 13911/0 گرم

براي تهيه پارانيتروفنل 08/0 ميلي مول در ليتر ، با استفاده از محاسبه زير ، مي بايست 11288/11 پارانيتروفنل (بطور تقريبي 1/11 ميلي گرم) در يك ليتر هيدروكسيد سديم (NaOH) 01/0 نرمال حل شود.

ميلي گرم ميلي گرم   گرم

اين محلول جذبي در حدود 2 خواهد داشت و با تهيه رقتهاي مختلف در سود (NaOH) 01/0 نرمال مي توان خطي بودن در محدوده جذب 1/0 تا 2 را در طول موج 405 نانومتر و در مقابل بلانك سود ، بررسي نمود. بطور مثال با تهيه محلول هايي با غلظت 0.01, 0.02, 0.04, 0.06 و 0.005 ميلي مول در ليتر نتايج زير بدست آمده و Bias محاسبه گرديده است.

همانطور كه قبلاً گفته شد جذب نوري حدود 0.4 را ملاك قرار داده و با تناسب مانند مثال زير جذب نوري مورد انتظار هر غلظت را محاسبه نماييد.

                                                                                    جذب نوري               غلظت

                                           0.463                     0.02

                                    x                        0.04

جدول 3-1

% Biasجذب نوري بدست آمدهجذب نوري مورد انتظارغلظت محلول پارانيتروفنل
3908/1852/108/0
2418/1389/106/0
2/1937/0926/004/0
463/002/0
6/2225/0231/001/0
6/2113/0116/0005/0

براي بررسي خطي بودن در طول موج 340 نانومتر از محلول دي كرومات پتاسيم استفاده مي شود. براي تهيه محلول ، پودر دي كرومات را در oven با حرارت 110 درجه سانتي گراد به مدت يكساعت خشك كرده و 200 ميلي گرم آن را با اسيد سولفوريك 01/0 نرمال به حجم 1 ليتر برسانيد. اين محلول را بعنوان ذخيره در شيشه تيره نگهداري نمائيد. محلول ذخيره جذبي در حدود 2 خواهد داشت و با تهيه رقتهاي مختلف در اسيد سولفوريك 01/0 نرمال، مي توان خطي بودن در محدوده جذب 0.1 تا 2 را در مقابل بلانك اسيد سولفوريك ، در طول موج 340 نانومتر بررسي نمود. بطور مثال با تهيه محلول هايي با غلظت 200 ، 150 ، 100 ، 50 ، 25 و 10 ميلي گرم در ليتر نتايج زير بدست آمده و Bias محاسبه گرديده است.

جذب نوري               غلظت

493/0                     50

x                                  25

مشابه مثال قبل جذب نوري حدود 4/0 را ملاك قرار داده و با تناسب مانند مثال زير جذب نوري مورد انتظار هر غلظت را محاسبه نماييد.

جدول 4-1

% Biasجذب نوري بدست آمدهجذب نوري مورد انتظارغلظت محلول دي كرومات پتاسيم
8/1007/2972/1200
5/0486/1479/1150
5/0991/0986/0100
493/050
8/0245/0247/025
4095/0099/010

ميزان عدم صحت مجاز در هر رقت حداكثر 5% پيشنهاد مي شود ولي بهتر است اين مقدار را بر اساس دستور العمل سازنده تعيين نمود.

2- صحت فتومتريك

بررسي صحت فتومتري با استفاده از محلول دي كرومات پتاسيم : بيش از 50 ميلي گرم از دي كرومات پتاسيم را به مدت يكساعت در درجه حرارت 110 درجه سانتي گراد قرار داده تا خوب خشك شود. سپس با ترازوي كاليبره ، دقيقاً 50 ميلي گرم از ماه فوق برداشته و در يك ليتر اسيد سولفوريك 01/0 نرمال حل مي گردد. سپس اسپكتروفتومتر توسط بلانك اسيد سولفوريك 01/0 نرمال در طول موج 350 نانومتر صفر شده و جذب نوري محلول دي كرومات پتاسيم در اسيد سولفوريك قرائت مي گردد. جذب نوري در محدوده 005/0  536/0 نشاندهنده صحت فتومتريك دستگاه مي باشد.

يادآوري 5 : بررسي صحت فتومتري با استفاده از روش گفته شده براي فتومتر امكان پذير نمي باشد (بعلت عدم دسترسي به طول موج 350 نانومتر). اين بررسي مي بايست با استفاده از محلول ها يا فيلتر هاي مناسب و توسط شركتهاي پشتيبان، انجام گردد.

(مواد استاندارد مرجع SRM جهت كاليبراسيون و تاييديه عملكرد اسپكتروفتومتر و فتومتر توسط انستيتوي مواد مرجع و روشها در اروپا IRMM و انستيتوي ملي استاندارد و تكنولوژي امريكا معرفي شده است.

www.nist. gov (   /bcwww.irmm.irc.

3- صحت طول موج

ارزيابي صحت طول موج به منظور ارزيابي ادعاي سيستم در تاباندن طول موجي است كه دستگاه براي آن تنظيم شده است.

راحت ترين و قابل دسترس ترين روش براي اسپكتروفتومتر هايي كه با نور مرئي كار مي كنند ، استفاده از محلول سيان مت هموگلوبين (20 ميكروليتر خون و 5 ميلي ليتر درابكين) بوده كه داراي حداكثر جذب نوري در طول موج 540 نانومتر است. ابتدا با محلول درابكين به عنوان بلانك دستگاه را صفر كرده و سپس جذب نوري نمونه در طول موج 530 ، 535 ، 545 و 550 نانومتر قرائت مي گردد. (لازم بذكر است پس از هر تغيير طول موج ، بايد جذب نوري دستگاه با محلول بلانك صفر گردد. ) بر اساس طول موج و ميزان جذب ، يك منحني رسم مي گردد كه در صورت وجود صحت طول موج ، حداكثر جذب نوري را در 540 نانومتر نشان خواهد داد.

يادآوري 6 : بررسي  صحت طول موج با استفاده از روش گفته شده براي فتومتر امكان پذير نمي باشد. اين بررسي مي بايست با استفاده از محلول ها يا فيلتر هاي مناسب و توسط شركت هاي پشتيبان ، انجام گردد.

4- آزمون رانش فتومتري (Drift)

يكي از منابع اصلي خطا در اسپكتروفتومتري ، كه به علت فرسودگي شديد منبع نوري رخ مي دهد، عدم پايداري مقدار جذب خوانش شده در طول زمان مي باشد.

براي بررسي ، ابتدا دستگاه را با درابكين صفر نموده و پس از ريختن محلول سيان مت هموگلوبين در كووت و بستن درب ان با پارافيلم ، جذب نوري اين محلول در هر 5 تا 15 دقيقه يكبار 0بمدت يكساعت) قرائت مي گردد. حداكثر تغيير مجاز در جذبهاي نوري قرائت شده طي اين مدت  مي باشد.

بعنوان مثال اگر جذب محلولي در ابتدا 259/1 باشد در مدت يكسال مي تواند در محدوده  تغيير نمايد.

5- نورهاي ناخواسته (Stray light)

نورهاي ناخواسته ، نورهايي هستند كه غير از نور عبور داده شده از منوكروماتور ، به نمونه تابيده مي شوند. براي اينكار محلولي كه نور را به طور كامل جذب مي كند (مثل استن يا نيتريت سديم در طول موجهاي خاص) در مسير عبور نور قرار داده مي شود. در اين حالت مي بايست ترانس ميتانس 0% (جذب بي نهايت و غير قابل خوانش) باشد زيرا نور از محلول عبور نكرده و به دتكتور نمي رسد.

براي بررسي انوار ناخواسته محلول آبي 50 گرم در ليتر سديم نيتريت تهيه و در مقابل بلانك آب مقطر در طول موج 300 تا 385 نانومتر خوانش مي شود. ترانس ميتانس مي بايد  باشد.

يادآوري 6 : آزمايشگاه هايي كه از فتومتر استفاده مي نمايند ، از بين پارامتر هاي گفته شده تنها مي توانند خطي بودن ، رانش فتومتري و انوار ناخواسته را بررسي نمايند . ساير موارد ذكر شده و همچنين دماي محفظه بايد از طريق شركت پشتيبان بررسي شود.

سانتريفيوژ

سانتريفيوژ يكي از راه هاي جدا سازي است كه در آن با استفاده از نيروي گريز از مركز ، قسمت هاي سبكتر يك محلول ، مخلوط و يا سوسپانسيون ، از قسمت هاي سنگين تر آن جدا مي شود.

اساس عمل سانتريفيوژ ، حركت دوراني حول يك محور ثابت است. نيروي سانتريفيوژ يا Centrifugal Force (RCF) Relative بستگي به شعاع و سرعت دوران داشته ، با فرمول زير محاسبه و واحد آن نيز بر اساس ضريبي از (gravity) g بيان مي شود.

(بطور مثال g × 500)

مقدار تجربي قرار دادي

شعاع سانتريفيوژ بر حسب سانتي متر = r

مقدار شعاع ، از مركز چرخش سانتريفيوژ (محور) تا انتهاي لوله درون سانتريفيوژ گيري مي شود

سرعت چرخش بر حسب دور در دقيقه = rpm

نيروي سانتريفيوژ RCF را مي توان به وسيله نموگرام نيز تعيين نمود.

در اين حالت با كشيدن خطي كه از شعاع سانتريفيوژ و g مورد انتظار عبور مي كند و ادامه آن ، سرعت بدست مي آيد. بعنوان مثال شكل فوق براي بدست آوردن قدرت 500g در سانتريفيوژي كه شعاع آن 75 ميلي متر است ، لازم است سرعت روي 2500 دور در دقيقه تنظيم گردد.

انواع سانتريفيوژ

سانتريفيوژ هاي شناور (Horizontal –head / Swinging – bucket )  و سانتريفيوژ هاي زاويه ثابت ، انواعي از سانتريفوژ هستند كه بيشتر در آژمايشگاه هاي تشخيص طبي استفاده مي شوند.

در سانتريفيوژ هاي شناور لوله ها در حالت توقف وضعيت عمودي و در حال حركت وضعيت افقي دارند.

در سانتريفوژ هاي زاويه ثابت ، لوله ها در همه حال زاويه ثابت نسبت به محور سانتريفيوژ مي باشند.

سرعت اين نوع سانتريفوژ ، مي تواند نسبت به مورد قبلي بيشتر باشد ولي در زمان چرخش بعلت مقاومت به هوا ، درون آن گرماي بيشتري ايجاد شده و دما بالا مي رود.

انتخاب سانتريفيوژ در آزمايشگاه بايد با توجه به نوع مصرف (مانند سرعت مورد نياز ، حداكثر دماي قابل قبول و … ) و نيز مختصات فني مندرج در كاتالوگ دستگاه صورت گيرد.

نكات مهم در استفاده از سانتريفيوژ :

  • در كار روزانه نبايد سانتريفيوژ را با درب باز به كار انداخت.
  • استفاده از لوله هاي مناسب و توصيه شده سازنده و رعايت توازن لوله ها و حجم نمونه ها هنگام استفاده از سانتريفيوژ از نكات اساسي در استفاده صحيح سانتريفيوژ مي باشد. بطور معمول وزن لوله هاي حاوي نمونه كه مقابل هم قرار گرفته اند نبايد بيش از 1% متفاوت باشند. وزن مجموع لوله هاي حاوي نمونه نبايد از وزن تعيين شده سازنده براي سرعت خاص ، تجاوز نمايد.
  • لازم است درب لوله هاي حاوي خون قبل از سانتريفيوژ بسته شود تا از پخش ائروسل در محيط جلوگيري گردد. از استفاده از اپليكاتور چوبي جهت خارج كردن لخته قبل از عمل سانتريفيوژ به علت افزايش احتمال هموليز بايد خود داري شود.

نگهداري و كنترل كيفيت سانتريفيوژ :

تميز نگهداشتن سانتريفيوژ در كاهش انتشار آلودگي ها بسيار مهم است و بايد در فواصل زماني مشخص انجام شود.

براي كنترل كيفيت سانتريفيوژ لازم است موارد زير بررسي گردد :

سرعت سانتريفيوژ : ابزار سنجش سرعت سانتريفيوژ ، تاكتومتر است. سرعت سانتريفيوژ بايد حداقل هر سه ماه يكبار بررسي شده و ميزان سرعت اندازه گيري شده نبايد بيش از 5% با سرعت مورد انتظار (سرعت انتخابي هنگام كار با سانتريفيوژ) متفاوت باشد. براي بررسي سرعت سانتريفيوژ با تاكتومتر مراحل زير انجام مي شود :

  • قفل سانتريفيوژ را در حاليت قرار دهيد كه در حال باز بودن در ، چرخش انجام شود.
  • كاغذ مخصوص همراه تاكتومتر را نزديك مركز محور سانتريفيوژ (نه در روي مركز محور) بچسبانيد . اين كار باعث مي شود در هر بار چرخش ، نور يكبار از كاغذ مخصوص به تاكتومتر باز تابيده شود.
  • سانتريفيوژ را با دور مورد نظر تنظيم نموده و روشن كنيد.
  • تاكتومتر را در فاصله مناسب نسبت به كاغذ نشاندار نگهداشته و آنرا روشن كنيد.
  • هنگاميكه عدد نمايش داده شده روي تاكتومتر ثابت ماند ، آن را يادداشت نموده با سرعت انتخاب شده اوليه مقايسه نمائيد.

زمان سنج سانتريفوژ : بهتر است زمان سنج بطور هفتگي در مقابل زمان سنج كاليبره مورد بررسي قرار گيرد. براي اين امر زمان سنج را در زمان هاي مختلف تنظيم و با كرونومتر مقايسه كنيد. اعداد حاصله نبايد بيش از 10% با زمان مورد انتظار متفاوت باشد.

كنترل دما : برخي سانتريفيوژ ها هنگام كار ايجاد حرارت زياد در محفظه داخل سانتريفيوژ مي نمايند و اين دما مي تواند بر كيفيت نمونه و غلظت كميت هاي آن تاثير گذار باشد لذا هنگامي كه اندازه گيري كميتي مورد نظر است كه به دما حساس مي باشد ، بهتر است از سانتريفيوژ يخچال دار استفاده شود. براي كنترل دما ، مي توان در لوله آزمايش ، آب مقطر ريخته دماي آنرا تعيين نمود. سپس لوله در سانتريفيوژ قرار گرفته و دستگاه با دور مشخص روشن مي شود. پس از مدت مقرر ، دماي آب داخل لوله مجدد اندازه گيري مي شود. دماي سانتريفيوژهاي يخچال دار مي بايد هر ماه بررسي شده ميزان و دماي اندازه گيري شده نبايد بيش از 2 درجه سانتي گراد با دماي مورد انتظار متفاوت باشد.

بن ماري

براي انجام آزمايش در محيط مرطوب و دماي خاص از بن ماري استفاده مي شود. براي استفاده مناسب از بن ماري بايد به موارد زير توجه داشت.

1- سطح آب در بن ماري بايد بالاتر از سطح مايعات انكوبه شده باشد.

2- آب بن ماري بادي مرتباً تعويض گردد تا از رشد ميكروبها جلوگيري بعمل آيد.

3- براي جلوگيري از ايجاد رسوب بهتر است از آب مقطر براي پركردن بن ماري استفاده شود. در صورت ايجاد رسوب مي توان از اسيد كلريدريك رقيق براي از بين بردن رسوب ها استفاده نمود.

4- براي اطمينان از دماي بن ماري مي بايست دماي آب ، روزانه بوسيله دماسنجي غير از دماسنج درون بن ماري ، كنترل گردد.

5- در مورد بن ماري هايي كه فاقد سيركولاتور آب مي باشند ، لازم است در چهار گوشه بن ماري دماسنج هاي دقيق قرار گرفته و نتايج آن با دماسنج درون بن ماري مقايسه گردد.

6- ميزان خطاي مجاز دما براي آزمايش هاي نقطه پاياني  مي باشد.

يخچال

براي استفاده صحيح از يخچال بايد به موارد زير توجه داشت :

1- يخچال ها بايد طوري قرار گيرند كه هواي كافي از مبرد كه عموماً در پشت يخچال است ، عبور نمايد.

2- دماي يخچال بايد روزانه دو بار در ساعات مشخص ، اندازه گيري و ثبت شود. با توجه به امكان وجود اختلاف دما ، درجه حرارت بخش هاي مختلف يخچال بايد بررسي گردد.

3- محفظه يخ بايد هر ماه بررسي و در صورت وجود يخ تميز شود.

4- غبار روي مبرد ماهانه پاك شود.

5- لاستيك دور در ، مرتباً بررسي شود.

ترازو

عواملي مانند دما ، رطوبت ، نيروي جاذبه و هوا مي توانند در اندازه گيري صحيح وزن مواد تداخل نمايند.

براي نگهداري و براي استفاده صحيح از ترازو بايد به موارد زير توجه داشت :

1- ترازو بايد در محلي دور از جريان هوا ، دقيقاً در وضعيت افقي و در مكاني ثابت و بدون ارتعاش قرار گيرد.

2- ترازو بايد پيش از هر اندازه گيري صفر شود.

3- ظرفي كه براي توزين استفاده شود بايد تا حد امكان كوچك باشد (با توجه به حجم ماده مورد توزين ). از بكار بردن ظروف پلاستيكي بايد خوداري شود.

4- ظرف و ماده مورد توزين بايد قبل از توزين به حرارت اتاق رسانده شوند.

5- دست را نبايد وارد محفظه توزين نمود زيرا باعث گرم شدن محفظه مي شود. بهتر است از پنس استفاده شود.

6- ماده مورد توزين را بايد وسط كفه قرار داد.

7- ترازو بايد تميز نگه داشته شود . در صورت ريختن مواد شيميايي بايد سريعاً محل را تميز نمود. برلي پاكسازي عوامل بيولوژيك از الكل 70 درصد استفاده مي شود.

8- براي اطمينان از صحت اندازه گيري لازم است علاوه بر كاليبراسيون داخلي ، در فواصل زماني مشخص با استفاده از وزنه هاي كاليبره با وزن معين، صحت عملكرد را بررسي كرد يا از طريق مراجع كاليبراسيون معتبر ، اقدام به كاليبراسيون دستگاه نمود.

سيستم هاي تخليص آب

اب خالص يكي از اركان ضروري بسياري از فعاليت هاي آزمايشگاهي مي باشد. درجه خلوص مورد نياز آب به مورد مصرف آن بستگي دارد.

براي تهيه آب از روش هاي تقطير ، اسموز معكوس و ديونيزه كردن استفاده مي شود. از آنجائيكه هيچيك از اين روش ها به تنهايي ، معيارهاي NCCLS (كميته ملي استاندارد هاي آزمايشگاهي امريكا كه به CLSI تغيير نام داده است) براي آب نوع I را تامين مي نمايند ، در صورت نياز به اين نوع آب بايد دو روش تخليص را با هم استفاده نمود.

توانايي روش هاي مختلف تخليص آب در برداشت ناخالصي هاي به تفكيك نوع روش بر اساس دستورالعمل NCCLS در جدول 5-1 آمده است.

جدول 5-1

  Major Classes of Contaminants    Purification Process
Pyrogens/ EndotoxinsMicro- organismsParticulate MatterDissolved OrganicsDissolved Ionized GasesDissolved Ionized Solids
EEEGEDistillation
PPPPEE  Deionization
EEEGPGReverse osmosis
PPPPPCarbon adsorption/ absorbtion
PEEPPPFiltration (0.22mm)
PEEPPPUltrafiltration

E : Excelent              G : Good                         P : Poor

موارد استفاده از انواع آب بشرح زير مي باشد.

نوع III : براي شستشوي ظروف شيشه اي و آزمايشهاي كيفي مانند تجزيه ادرار

نوع II : در روش هاي معمول آزمايشگاهي كه به نوع I احتياج ندارد.

نوع I : مواردي كه كمترين تداخلات و بيشترين صحت مورد نياز است مانند اندازه گيري عناصر كمياب

نگهداري انواع آب : آب نوع I امكان نگهداري نداشته و بايد بلافاصله بعد از تهيه مصرف گردد. آب نوع II و III را مي توان در ظروف بوروسيليكات يا پلي اتيلن با درب محكم براي مدت كوتاهي نگهداري نمود.

پيشنهاد مي گردد براي اطمينان از كيفيت آب حداقل 3 شاخص مقاومت آب ، آلودگي ميكروبي و در مورد آب نوع PH, III بررسي گردد.

براي بررسي مقاومت آب از هدايت سنج يا كنداكتومتر استفاده مي شود كه ميزان هدايت آب را اندازه مي گيرد. هدايت با مقاومت نسبت عكس دارد (Conductivity = 1/ resistance ) . مقاومت براي آب نوع II, I و III به ترتيب  10 ، 2 و 1/0 مي باشد پس هدايت به ترتيب معادل  1/0 ، 5/0 و 10 خواهد بود. اندازه گيري هدايت آب بايد پس از اندازه گيري دما با دماسنج كاليبره و بر اساس دستور العمل هدايت سنج صورت گيرد.

براي بررسي آلودگي ميكروبي مي بايست اجازه داد آب براي حداقل يك دقيقه به راحتي از دستگاه خارج شود سپس در يك ظرف استريل 10 ميلي ليتر آب جمع آوري مي شود. آزمايش بايد در مدت يكساعت از جمع آوري آب انجام شود در صورت عدم امكان كشت در مدت يكساعت ، نگهداري براي 6 ساعت در دماي 8-2 درجه امكان پذير است. بعد از مخلوط كردن آب (كه با 10 بار سر و ته كردن بدست مي آيد) ، 1 ميلي ليتر از آب در پتري ديش ريخته مي شود. سپس محيط كشت ذوب شده تا دماي 50-46 درجه سرد و در پتري ديش ريخته مي شود ( از محيط هاي TSA, BHI يا هر محيط كشتي كه از رشد باسيلهاي گرم منفي پشتيباني كند ، مي توان استفاده نمود). با چرخاندن پتري ديش ، آب را با محيط كشت مخلوط نمائيد. پس از سرد شدن و جامد شدن آگار ، ديش بطور وارونه و بمدت 24 ساعت در دماي  درجه سانتير گراد و سپس 24 ساعت در دماي  درجه سانتيگراد قرار مي گيرد (مدت انكوباسيون مجموعاً 48 ساعت مي باشد ) رشد ميكروبي بصورت cfu/ mL گزارش مي شود.

استفاده از لوپ براي كشت آب مجاز نمي باشد.

اندازه گيري pH براي آب نوع 3 با استفاده از pH meter و بر اساس دستور العمل pH meter انجام مي شود.

در صورت خريد آب ، مي بايست مشخصات آب از طرف توليد كننده ارائه گردد. پيشنهاد مي شود آزمايشگاه در فواصل معين نسبت به كنترل آب خريداري شده اقدام نمايد.

بايد در نظر داشت انواعي از آب استريل كه به صورت ويال عرضه مي شود ، الزاماً از كيفيت مورد نياز ازمايشگاه برخوردار نبوده و بايد قبل از استفاده ، ميزان هدايت آن بررسي شود.

يادآوري 7 : حجم ادعا شده ويال هاي آب ، نبايد مبنايي براي به حجم رساندن كنترل ها ، كاليبراتور ها ، معرفها و … ، باشد. آزمايشگاه مي بايست صرف نظر از حجم مندرج روي ويال ، با استفاده وسايل حجمي مناسب مانند پيپت اقدام به انتقال حجم مورد نياز نمايد.

ميكروسكوپ

براي حفظ كيفيت عملكرد ميكروسكوپ آگاهي از نحوه نگهداري صحيح نگهداري آن از اهميت ويژه اي برخوردار مي باشد كه در زير به نكاتي در اين مورد اشاره مي شود :

1- هنگامي كه از ميكروسكوپ استفاده نمي شود ، لامپ آن خاموش و با روكش مناسب پوشانده شود.

2- بلافاصله پس از استفاده ، روغن ايمرسيون از روي عدسي هاي شيئي پاك شود.

3- قبل و بعد از استفاده از ميكروسكوپ ، قسمت هاي نوري با دستمال مخصوص لنز ، كاغذ هاي جاذب يا پارچه نرم آغشته به محلولي متشكل از يك حجم اتر و يك حجم ايزوپروپيل الكل ، پاك شود.

4- براي پاك كردن لنز ها نبايد از گزيلل استفاده شود. لنز ها نمي بايست در الكل خيسانده شوند.

5- در حال مشاهده لام ، براي وضوح تصوير ، هيچگاه عدسي هاي شيئي را خيلي پائين نبريد زيرا ممكن است منجر به خراشيدگي اسلايد و صدمه به لنز شود.

6- عدسي هاي شيئي نبايد از ميكروسكوپ جدا شوند.

7- در هواي گرم و مرطوب به منظور جلوگيري از رشد قارچ بر روي لنز ها ، مي توان ميكروسكوپ را هر عصر در محفظه اي كه با يك يا دو لامپ 40 وات گرم شده و محيط خشكي فراهم آورده ، قرار داد. بايد توجه داشت دماي آن محفظه نمي بايست بيش از 5 درجه از دماي آزمايشگاه بالاتر باشد.

8- در هواي گرم و خشك كه مشكل اصلي گرد و غبار است ، علاوه بر پوشاندن ميكروسكوپ در ساعات غير كاري ، در پايان روز مي بايست گرد و غبار لنز ها را با دميدن هوا از وسيله اي مانند پوار يا با استفاده از برس مخصوص لنز يا قلم موي نقاشي و در صورت لزوم كاغذ مخصوص لنز (Lense paper) تميز نمود.

2-5- كنترل كيفيت در بخش بيوشيمي

کنترل متغيرها در بخش انجام آزمايش

متغير هاي مرحله انجام آزمايش را مي توان به دو روش استفاده از نمونه كنترلي و تعميم نتايج آن به پاسخ هاي بيماران (كنترل كيفيت آماري) و نيز استفاده از نتايج بيماران (دلتا چك ، آزمايش هاي مضاعف و …) تحت كنترل قرار داد.

كنترل كيفيت آماري

در كنترل كيفيت آماري نمونه كنترلي (بعنوان نماينده يك گروه از نمونه بيماران) مورد آزمايش قرار گرفته و نتايج آن با مقدار مورد انتظار كه اغلب بصورت يك محدوده تعريف شده ، مقايسه مي گردد. اگر نتيجه آزمايش نمونه كنترلي ، در محدوده مورد انتظار قرار بگيرد ، پاسخ هاي آزمايش بيماران نيز قابل قبول شناخته مي شوند و برعكس اگر خارج از محدوده مورد انتظار قرائت شود ، احتمال وجود خطا در سيستم آزمايش مطرح شده و طبيعتاً پاسخ هاي بيماران نيز غير قابل قبول شناخته مي شوند.

انتخاب مواد كنترلي

در انتخاب مواد كنترلي موارد زير بايد مورد توجه قرار گيرند :

1. پايداري : كنترل مي بايست براي مدت طولاني پايدار و در عين حال فاقد مواد نگهدارنده مداخله گر باشد. در اين حالت مصرف كننده اين امكان را دارد كه مواد كنترلي مورد نياز خود را براي مدت مشخص ، يكجا تهيه نمايبد. (بهتر است كنترلها براي مصرف يكسال خريداري شوند)

2. مشابهت با نمونه انساني مورد آزمايش : بهتر است كنترل با توجه به نمونه انساني مورد آزمايش انتخاب گردد. بعنوان مثال كنترل هاي با پايه سرم ، ادرار ، خون ، CSF و …

كنترل ها با پايه انساني ارجع مي باسند ولي به علت احتمال آلودگي با عوامل بيماري زا بعضاً كنترل هاي با پايه سرم گاوي نيز مورد استفاده قرار مي گيرند.

3. يكنواختي : ويال هاي مختلف كنترل بايد هموژن و يكنواخت بوده و غلظت آناليت هاي موجود در آنها يكسان باشد.

4. عدم وجود اثرات زمينه اي (Matrix effect) : براي انتخاب سرم كنترل بايد همخواني آن با معرف هاي مورد استفاده در نظر گرفته شده و از عدم وجود اثرات زمينه اي اطمينان حاصل گردد.

5. بسته بندي مناسب : ويال بدون نشتي بوده و به حجم رساندن و نگهداري كنترل به سهولت انجام شود.

6. قيمت ارزان و تعداد زياد مصرف كنندگان

7. عاري از عوامل بيماري زا : مثل باكتري ، قارچ ، ويروس و پريون

هر دو كنترل هاي ليوفيليزه يا كنترل هاي مايع قابل استفاده مي باشند اما در زمان انتخاب بايد مزايا و معايب هر يك در نظر گرفته شود. بعوان مثال خطا در به حجم رساندن كنترل هاي ليوفيليزه ممكن است منجر به بروز مشكلاتي شود در حاليكه كنترل هاي مايع ، آماده مصرف هستند . در عين حال مواد موجود در كنترل هاي مايع ممكن است در برخي روش ها تداخل نموده و باعث خطا شوند.

براي كنترل داخلي كيفيت ، بهتر است حتي المكان دو غلظت مختلف از كنترل استفاده شود. انتخاب غلظت هاي نزديك به محدوده تصميم گيري باليني (Decision level) ارجع مي باشد. مانند غلظت 126 و 200 ميلي گرم در دسي ليتر براي گلوكز . برخي پيشنهاد مي نمايند غلظت كنترل ها طوري انتخاب مي شوند كه محدوده گزارش دهي روش ازمايشگاهي (Reportable range) را پوشش دهند. بعنوان مثال اگر بنا بر ادعاي سازنده ، محدوده گزارشدهي كيت اندازه گيري گلوكز ، 30 تا 400 ميلي گرم در دسي ليتر است ، مي توان كنترل هايي با غلظت تقريبي 40 و 380 ميلي گرم در دسي ليتر را انتخاب نمود.

مواد كنترلي به دو شكل داراي مقادير مشخص (assayed) و فاقد مقادير مشخص (un assayed)  موجود و هر دو نوع آنها براي بررسي دقت (precision) قابل استفاده مي باشند.

يادآوري 8 : مواد كنترلي نمي توانند بعنوان جايگزين كاليبراتور استفاده شوند. كاليبراتور ماده اي است كه براي كاليبراسيون روش آزمايشگاهي بكار مي رود و داراي مقدار مشخص است در حالي كه مواد كنترلي براي كنترل كيفيت روش آزمايشگاهي بكار مي رود و اغلب داراي محدوده غلظتي مي باشد.

يادآوري 9 : در خريد كاليبراتور و مواد كنترلي به همخواني معرف با كاليبراتور و كنترل تجاري توجه داشته باشيد. اين موضوع را مي توانيد از شركت پشتيبان كيت و معرف استعلام نمائيد.

يادآوري 10 : به حجم رساندن مواد كنترلي ليوفيلزه مي بايست با وسايل حجمي مناسب و طبق دستور العمل سازنده صورت پذيرد.

خطاي مجاز

اولين قدم در اجراي فرآيند كنترل داخلي كيفيت در بخش آناليتيك ، تعيين خطاي مجاز مي باشد. عليرغم تمامي تلاشها ، وجود خطا در آزمايشگاه ها حتي در بهترين شرايط اجتناب ناپذير مي باشد. بطوريكه حتي اگر در يك آزمايشگاه ، يك كارشناس ، آزمايش ثابتي را با دستگاه و معرف مشخص بر روي نمونه واحد ، به دفعات انجام دهد ، اخذ نتايج مشابه و يكسان در تمامي موارد بعيد بنظر مي رسد. پس مسئول آزمايشگاه مي بايست با در نظر گرفتن مجموع شرايط آزمايشگاه (نوع دستگاه يا معرف مورد استفاده ، تجربه كاكنان و …) و نيز با توجه به سطح كيفيت مورد نياز خود ، ميزان عدم دقت (بر حسب CV% يا SD ) و عدم صحت (بر حسب Bias يا Bias% ) و يا مجموعا ً خطاي كلي مجاز خود را مشخص نمايد.

بعنوان مثال اگر عدم دقت مجاز براي كلسترول و بر حسب CV% معادل 2 % در نظر گرفته شود ، ميزان پراكندگي نتايج براي غلظت mg/ dL  200 به شكل محاسبه مي گردد.

از محاسبات بالا نتيجه مي گيريم ، به احتمال 95% اگر كلسترول يك نمونه با غلظت واقعي mg/ dL  200 چند بار اندازه گيري شود ، نتايج در محدوده mg/ dL  يعني  قرار خواهد گرفت.

خطاي مجاز بايد واقع بينانه و بر اساس شرايط آزمايشگاه ، بصورتي انتخاب شود كه بتواند ميزاني از خطا ، كه تصميم گيري باليني را متاثر مي سازد ، شناسايي نمايد. در عين حال آنقدر كوچك نباشد كه باعث رد كاذب مكرر نتايج گردد.

بعنوان مثال اگر آزمايشگاهي ميزان CV% مجاز خود را براي اندازه گيري گلوكز 8% تعريف نمايد و نمونه اي با غلظت واقعي mg/ dL 126 داشته باشد ، در 95% موادر احتمال دارد نتايجي در محدوده mg/ dL146-106 ارائه دهد كه اين طيف غلظتي وسيع ، مشخصا باعث اشتباه در تصميم گيري پزشك خواهد شد. اگر اين آزمايشگاه ميزان  CV% مجاز خود را به 1% تغيير دهد در غلظت mg/ dL 129-123 خواهد داشت كه اگر چه براي پزشك مطلوب است ، ولي باعث مي شود سري هاي كاري مكررا و بطور كاذب مردود (False rejection) شناخته شوند. اين امر خود منجر به افزايش دفعات تكرار آزمايش ، صرف هزينه و خستگي كاركنان مي گردد.

روش هاي و فرضيه هاي مختلفي كه براي تعيين مقادير خطاي مجاز استفاده گرديده ذيلا بطور مختصر معرفي شده است.

1- استفاده از محدوده مرجع (Reference Interval) : اين فرضيه در سال 1963 توسط Tonks مطرح گرديد. در اين روش با استفاده از فرمول زير ميزان خطاي كلي و CV محاسبه مي گردد.

از آنجائيكه محدوده مرجع تحت تاثير عوامل مختلفي مثل گروه مورد بررسي ، مشخصات روش ازمايشگاهي و غيره قرار دارد ، اين روش امروزه كمتر استفاده مي شود.

2- نظريه پزشكان : در اواسط دهه 1960 ، Barnett با نظر سنجي از پزشكان ، خطاي مجاز را تعيين نمود.

3- شرايط موجود : در اين روش از نتايج ازمون مهارت (Proficiency testing) و مقادري عدم دقت و عدم صحت bias متد هاي موجود براي تعيين خطاي مجاز استفاده مي شود.

در قوانين (Clinical Laboratory Improvments Amendments) CLIA يا اين روش مقادير خطاي مجاز براي حدود 80 كميت تعيين شده است.

4- نظريه افراد و گروههاي كارشناس : در مورد برخي پارامتر ها ، گروه هاي كارشناس مقادير CV و Bias مجاز را تعيين نمودند. مثال آن مشخص نمودن مجاز TG, HDL, Chol, LDL توسط National cholesterol education program (NCEP) مي باشد. مقادير حاصل از اين روش براي تعداد محدوي از آزمايش ها قابل دستيابي مي باشد.

5- تغييرات بيولوژيك : در اين روش تغييرات يك پارامتر در مدت زماني مشخص ، در بدن يك فرد و افراد مختلف اندازه گيري و بر اساس ضريب انحراف درون فردي within subject و بين افراد مختلف between subject ، مقادير CV و Bias محاسبه مي گردد.

مقادير خطاي مجاز براي هر يك از كميت ها متفاوت بوده و آزمايشگاه بايد قبل از اجراي كنترل كيفيت ، با استفاده از يكي از مراجع فوق مقادير عدم دقت و عدم صحت مورد نياز خود را تعريف نمايد. بعنوان مثال جدول 1-2 مقادير عدم دقت مجاز بر حسب CV% را براي ليپيد ها ، از ديدگاه هاي مختلف نشان مي دهد. 

جدول 1-2

Biologic variationNCEPTest  
3%3%Chol
6/3%4%HDL
2/4%4%LDL
5/10%5%TG

همانطور كه در جدول مشاهده مي شود حتي براي يك كميت ، خطاهاي مجاز متفاوتي مطرح مي شود. لذا مجددا تاكيد مي نمايد آزمايشگاه مي بايست بر اساس نياز ها و امكانات خود از هر يك زا آنها استفاده نمايد.

اهداف كيفيت بر اساس معيار هاي CLIA و تغييرات بيولوژيك در پيوست شماره 1 آمده و براي كسب اطلاعات بيشتر مي توان به آدرس هاي زير مراجعه نمود.

http: //www.westgard.com/biodatabase1. htm

http: //www.westgard.com/ clia. hm

http: //www.westgard.com/ europe. htm

كليات نمودار كنترلي

رايج ترين روش براي مقايسه نتايج آزمايش نمونه هاي كنترل با مقدار مورد انتظار ، استفاده از نمودار كنترلي است. در نمودار كنترلي ، غلظت حاصله از آزمايش سرم كنترل روي نموداري با محدوده مشخص ، علامتگذاري و بصورت گرافيكي و ساده نمايش داده مي شود. اگر نتايج درون محدوده مشخص شده قرار گيرد ، شرايط تحت كنترل و عملكرد سيستم مناسب تشخيص داده مي شود. مشاهده نتايج خارج از محدوده نانگر بروز مشكل بوده و لزوم بررسي عملكرد سيستم را مطرح مي سازد.

براي بدست آوردن محدوده نمودار نمونه كنترلي به دفعات با استفاده از روش مورد استفاده آزمايشگاه ، آزمايش و سپس ميانگين و انحراف معيار نتايج حاصله ، محاسبه مي گردد.

همانطور كه در شكل زير مشاهده مي شود بطور معمول در صورتي كه نمونه اي مكررا ازمايش شود انتظار مي رود نتايج حاصله ، از توزيعي نرمال (توزيع گوسين) برخودار باشند. در يك توزيع نرمال 95% خوانده ها در محدوده   و 7/99% خوانده ها در محدوده  قرار مي گيرند. پس احتمال اينكه خوانده اي بطور اتفاقي خارج از محدوده  قرار گيرد حدود 5% (بعبارتي 1 نتيجه بين 20 خوانده) و در مورد محدوده  تنها 3/0% (3 نتيجه بين 1000 خوانده) مي باشد.

براي اينكه نمودار كنترلي مقدار و محدوده مناسبي داشته باشد مي بايست تاثير نتايج پرت (Outlier) را به حداقل برساند. زيرا وجود حتي يك خوانده پرت مي تواند ميانگين را جابه جا نموده و محدوده چارت را بسيار وسيع نمايد. براي جلوگيري از اين مشكل مي توان نتايج پرت را كه بطور معمول نتايج خارج از محدوده  فقط 003/0 (3 نتيجه بين 1000 نتيجه) مي باشد ، وجود حتي يك پرت (Outlier) احتمال وجود مشكل را مطرح كرده و پيگيري را الزامي مي سازد.

اجراي گام به گام كنترل داخلي كيفيت

1- با توجه به شرايط ازمايشگاه عدم دقت مجاز بر حسب CV% را مشخص نمائيد.

2- نمونه هاي كنتريل مناسب را حتي الامكان در دو غلظت انتخاب كنيد.

3- نمونه هاي كنترلي را به يكي از راه هاي زير ، 20 بار آزمايش نمائيد تا 20 خوانده بدست آيد :

3-1 بهتر است اين تعداد خوانده از تكرار آزمايش در 20 روز كاري (4 هفته) حاصل گردد.

3-2 روش ديگر ، انجام آزمايش بصورت دو تايي در 10 روز كاري است.

3-3 در صورت عدم امكان اجراي روش هاي فوق مي توان در 5 روز كاري ، نمونه كنترلي را 4 بار در هر روز ازمايش نمود.

طولاني شدن اين مرحله و آزمايش نمونه كنترلي در روز هاي كاري مختلف ، باعث مي شود با تاثير متغير هايي كه بطور معمول در آزمايشگاه وجود دارند ، نتايج واقعي تري بدست ايد. هر چه اين مرحله كوتاهتر شود تاثير متغير ها كمتر شده و نتايجي نزديك به هم حاصل مي گردند. بديهي است در اين شرايط محدوده چارت بسيار كوچک و غير واقعي شده و طبيعتاً در مراحل بعدي موارد رد كاذب نتايج (False rejection) افزايش مي يابد.

4- ميانگين ، انحراف معيار و ضريب انحراف را بر اساس فرمول هاي زير محاسبه نمائيد. انحراف معيار با استفاده از ماشين حساب يا برنامه هاي نرم افزاري يا به روش دستي قابل محاسبه است.

CV : ضريب انحراف (Coefficient of variation)

SD : انحراف معيار

Mean : ميانگين

n : تعداد خوانده ها

 : هر تك خوانده

5- قابليت تكرار پذيري SD) يا CV% ) بدست آمده را با عدم دقت مجازي كه قبلاً تعيين نموده ايد ، مقايسه نماييد. اگر نتايج در محدوده خطاي مجاز قرار داشت ، كار را طبق بند 6 ادامه دهيد. در غير اينصورت عوامل ايجاد خطا را جستجو و پس از رفع مشكل ، مجدداً مراحل 1-4 را اجرا نمايئد. در صورتيكه عليرغم بررسي متغير ها ، مشكل رفع نشده باشد با توليد كننده فرآورده يا دستگاه تماس بگيريد.

6- براي هر غلظت از نمونه كنترلي با استفاده از ميانگين و انحراف معيار چارت كنترلي را مانند شكل زير ترسيم نماييد.

7- در هر سري كاري حتي الامكان دو كنترل در دو غلظت مختلف را مورد آزمايش قرار داده و نتيجه را روي منحني مربوطه علامتگذاري نماييد.

بر اساس تعريف CLSI(NCCLS) سري كاري به مدت زمان يا تعداد نمونه اي اطلاق مي گردد كه طي آن صحت و دقت سيستم اندازه گيري ثابت باشد.

پس تعداد دفعات آزمايش سرم كنترل به مواردي مانند پايداري روش و سيستم استفاده بستگي دارد. اگر سيستمي براي مدت زمان مشخص يا تعداد آزمايش معين پايدار است ، در اين فاصله يكبار آزمايش نمونه كنترلي كافي است.

يادآوري 11:

محدوده اي كه در بروشور هاي كنترل هاي تجاري درج نشده نبايد براي ترسيم چارت كنترل كيفيت استفاده شود. اين محدوده عمدتا بر اساس آزمايش سرم كنترل ها در آزمايشگاه هاي مختلف تعيين مي شود و متغير هاي متعددي مانند اختلاف دستگاه ها ، شماره ساخت هاي مختلف كيت و كاليبراتور بر روي آن تاثير مي گذارند در نتيجه محدوده مندرج در بروشور بسيار بزرگتر از محدوده حاصل از عملكرد يك ازمايشگاه مي باشد. البته در شروع كار تا زماني كه تعداد نتايج به حد مطلوب نرسيده محدوده سرم كنترل قابل استفاده است.

لازم به ذكر است حتي در ابتداي كار ، تنها در صورتي مي توان از محدوده مندرج در بروشور كنترل استفاده نمود كه كنترل با روش آزمايشگاهي مورد استفاده همخواني داشته و اين موضوع مورد تاييد سازنده معرف يا دستگاه قرار داشته باشد.

يادآوري 12:

بايد توجه نمود كه افزايش تعداد كنترل ها در هر سري كاري اگر چه مي تواند باعث تشخيص بهتر خطا شود ولي بعلت افزايش ميزان رد كاذب باعث افزايش هزينه مي گردد. لذا پيشنهاد مي گردد در هر سري كاري يك يا دو كنترل ازمايش شود.

مثال :

آزمايشگاهي كه براي اندازه گيري كلسترول كيت جديدي خريداري نموده و براي ترسيم چارت كنترل كيفيت CV% مجاز را بر اساس NCEP 3% انتخاب و دو سرم كنترل با غلظت هاي نزديك به غلظت تصميم گيري (Decision level) را طي 5 روز كاري 20 بار آزمايش نموده است كه نتايج آن بشرح زير مي باشد.

جدول 2-2

روز اول200207190205
روز دوم205197204205
روز سوم196209196197
روز چهارم202200204196
روز پنجم190196200198

                    كنترل 2                                                             كنترل 1

روز اول247263261257
روز دوم250251254258
روز سوم255260239256
روز چهارم243253236249
روز پنجم254244250257

ميانگين ، انحراف معيار را براي سهولت كار ، گردو CV% را بشرح زير تعيين نموده است :

CV%SD(mg/dl)Mean(mg/dl) 
5/2%5200كنترل 1
8/2%7252كنترل 2

از آنجائيكه CV% حاصله در محدوده خطاي مجاز تعيين شده (3%) قرار دارد ، مي تواند چارت را ترسيم و نتايج كنترل ها را روي آن مشخص نمايد.

تفسير نتايج

براي تفسير نتايج چارت كنترل كيفيت معيار ها يا قوانين مختلفي توسط سازمان ها يا كارشناسان وضع شده است كه بر اساس آنها نتايج «تحت كنترل» يا خارج از كنترل در نظر گرفته مي شود. Levey –Jenning ، وستگارد و WHO 3 نمونه اي هستند كه در اين مجموعه مورد بحث قرار مي گيرند.

انتخاب هر يك از اين قوانين توسط آزمايشگاه مجاز مي باشد

1- چارت كنترلي Levey- Jenning

چارت هاي كنترلي براي اولين بار در سال 1950 توسط Levey و Jenning به آزمايشگاه ها معرفي شدند. آنها نشان دادند چگونه روش هاي كنترلي كه توسط Shewhart براي استفاده در صنعت مطرح گرديده بود ، مي تواند با محاسبه ميانگين و محدوده براي روش هاي آزمايشگاهي استفاده شود.

براي ترسيم و استفاده از چارت كنترلي Levey- Jenning مراحل زير را دنبال نمائيد :

1- نمونه كنترلي را 20 بار ازمايش و ميانگين و انحراف معيار را محاسبه نمائيد. (مطابق مراحل 1 تا 5 در بخش اجراي گام به گام كنترل داخلي كيفيت )

2- بطور دستي يا با استفاده از نرم افزار يك چارت كنترلي ترسيم كنيد بطوريكه محور y مقدار نمونه كنترل بوده و محدوده  را در بر گيرد.

3- اگر تعداد كنترل هايي كه در سري كاري استفاده مي شود 2 يا بيشتر باشد  را بعنوان محدوده قابل قبول انتخاب كنيد. اما اگر در هر سري كاري يك كنترل آزمايش مي شود محدوده  را ملاك قرار دهيد.

4- ميانگين و محدوده مورد قبول خود را بصورت افقي ترسيم نموده و خطوط عمودي را  مشخصه زمان انجام آزمايش قرار دهيد . در هر سري كاري كنترل ها را آزمايش و نتيجه را روي چارت علامتگذاري كنيد.

5- ماداميكه نتايج در محدوده مورد انتظار  يا  (با توجه به محدوده منتخب) قرار داشته باشد ، نتايج تحت كنترل و با خروج از اين محدوده خارج از كنترل شناخته مي شود.

مثال چارت كنترلي Levey- Jenning در مورد كلسترول با ميانگين 200 و انحراف معيار mg/dl4

يادآوري 13:

نكته : بعلت سهولت كار بسياري از آزمايشگاه ها از چارت كنترلي Levey- Jenning استفاده مي نمايند ولي بايد ر نظر داشت استفاده از هر يك از اين محدوده هاي  يا  داراي معايبي مي باشد اگر محدوده  انتخاب شود احتمال شناسايي خطا كاهش مي يابد در حاليكه رد كاذب (False rejection) كمتر از 5% است. اگر محدوده  در نظر گرفته شود ، احتمال تشخيص خطا افزايش مي يابد اما ميزان رد كاذب (False rejection) افزايش مي يابد.

با افزايش تعداد كنترل هايي كه در هر سري كاري ازمايش مي شوند (n ) ميزان رد كاذب افزايش مي يابد . در صورت استفاده از يك كنترل (n=1) رد كاذب 5% مي باشد ولي اين ميزان براي 2 كنترل (n=2) به 9% و براي 4 كنترل (n=4) به 18% مي رسد.

بعنوان مثال اگر آزمايشگاهي در هر سري كاري دو غلظت نمونه كنترلي را بصورت دوبل آزمايش نمايد ، در واقع در هر سري 4 كنترل را آزمايش كرده و رد كاذب نتايج اين ازمايشگاه به 18% مي رسد.

2- تفسير چارت كنترلي با قوانين چند گانه وستگارد :

به منظور افزايش احتمال تشخيص خطا و كاهش موارد رد كاذب نتايج ، قوانين چند گانه توسط وستگارد و همكاران ارائه گرديد. اين قوانين طوري طراحي شده اند كه ضمن حساس بودن به خطاهاي تصادفي و سيستماتيك ، ميزان رد كاذب نتايج را به كمتر از 01/0 مي رسانند.

براي استفاده از اين قوانين ، نمونه هاي كنتريل را 20 بار ازمايش و ميانگين و انحراف معيار را محاسبه نمائيد. (مطابق مراحل 1 تا 5 در بخش اجراي گام به گام كنترل داخلي كيفيت) سپس در هر سري كاري نمونه هاي كنترلي را ازمايش نمائيد.

ماداميكه كنترل ها در محدوده  قرار دارند ، نتايج بيماران را گزارش نماييد. ولي به محض اينكه يكي از كنترل ها از محدوده  خارج شد ، كار را متوقف و نتايج كنترل ها را از نظر وجود يكي از قوانين زير بررسي نمائيد.

 يك كنترل خارج از محدوده  بمعني هشدار بوده و لزوم بررسي ساير قوانين را مطرح مي سازد.

  يك كنترل خارج از محدوده  باعث رد نتايج شده و مي تواند نشاندهنده خطاي راندوم يا شروع خطاي سيستماتيك باشد.

 دو خوانده متوالي همسو و خارج از محدوده  باعث رد نتايج شده و به خطاي سيستماتيك حساس مي باشد.

 يك خوانده خارج از محدوده  و ديگري خارج از محدوده باعث رد نتايج گرديده و نشانگر خطاي راندوم مي باشد.

 4 خوانده متوالي و همسو ، خارج از محدوده  يا  باعث رد نتايج مي شود و به خطاي سيستماتيك حساس مي باشد.

 10 خوانده متوالي در يك طرف ميانگين(بالا يا پائين ميانگين و بدون توجه به اندازه انحراف) باعث رد نتايج مي شود و به خطاي سيستماتيك حساس مي باشد.

 لازم به ذكر است كه قوانين چند گانه وستگارد بين سري هاي كاري مختلف و نيز بين دو غلظت نمونه كنترلي نيز قابل استفاده مي باشند. بعنوان مثال در مورد قانون  ممكن است يك خوانده ديروز و يك خوانده امروز ، همسو و خارج از محدوده 2 SD قرار گرفته باشد تا در يك سري كاري، يك خوانده در كنترل 1 و خوانده ديگر در كنترل 2 (نتايج هر دو كنترل) خارج از محدوده 2 SD قرائت گردند.

مورد استثنا قانون  است كه در آن بايد دو خوانده بدست آمده از يك سري كاري با يكديگر4 SD فاصله داشته باشند. اگر در دو سري كاري متفاوت ، نتايج با هم 4 SD فاصله داشته باشند ، اين قانون كاربرد ندارد.

يادآوري 14:

در سال 2006 با توجه به پيشرفت هاي تجهيزات و نيز كامپيوتري شدن بسياري از برنامه ها، دو تغيير در قوانين وستگارد ايجاد شد. اول اينكه قانون  به عنوان هشدار حذف گرديد و پيشنهاد شد قوانين  و حتي در شرايطي كه نتيجه در محدوده  دارد ، اعمال شود. اين امر اگرچه منجر به تشخيص سريعتر خطا مي شود ولي انجام صحيح آن در مواردي كه چارت بصورت دستي ترسيم شده بسيار مشكل است. همچنين با توجه به شرايط فعلي برخي از آزمايشگاه ها ، ممكن است استفاده و تفسير بدرستي انجام نشده و هزينه اجراي كنترل كيفيت را بالا ببرند. لذا مولف توصيه مي نمايد چنانچه چارت بصورت دستي ترسيم مي شود ، مطابق با نظريات قبلي وستگارد ، قوانين زماني بررسي مي شوند كه حداقل يك نتيجه خارج از محدوده  قرائت شده باشد.

تغيير دوم اينكه در صورت استفاده از 3 يا 6 كنترل در هر سري كاري (مضرب 3) قوانين تفسير تا حدي متفاوت مي باشند.

براي كسب اطلاعات بيشتر در مورد تغييرات فوق مي توان به سايت وستگارد مراجعه نمود.

مثال 1 : در شكل هاي زير قوانين وستگارد با ازمايش يك كنترل در هر سري كاري نمايش داده شده است.

مثال 2 : در شكل هاي زير قوانين وستگارد با آزمايش دو كنترل در هر سري كاري ، نمايش داده شده است.

در سري سوم كاري هر دو كنترل خارج از محدوده 2 SD + هستند پس بر اساس قانون  اين سري كاري رد مي شود.

به احتمال زياد يك خطاي سيستماتيك در اين محدوده غلظتي وجود دارد.

در سري چهارم كاري كنترل با غلظت بالا ، خارج از محدوده قرار گرفته و احتمال خطا وجود دارد. از آنجائيكه سري كاري قبلي (سري سوم) رد شده است فقط سري چهارم از نظر وجود قوانين  و   و  بررسي مي گردد. با توجه به عدم وجود 3 قانون  نامبرده ، اين سري كاري قبول مي شود ولي بايد به هشدار توجه نمود.

در سري هفتم كاري نتيجه كنترل با غلظت بالا خارج از محدوده  قرار گرفته كه باعث رد اين سري كاري مي گردد.

به احتمال زياد يك خطاي راندوم وجود دارد.

در سري نهم كاري كنترل با غلظت بالا ، خارج از محدوده  قرار گرفته و احتمال خطا وجود دارد. چارت از نظر وجود قوانين  و   و  بررسي مي گردد. با توجه به عدم وجود 3 قانون نامبرده ، اين سري كاري قبول مي شود ولي بايد به هشدار توجه نمود.

در سري دهم كاري در چارت كنترل با غلظت بالا ، دو خوانده متوالي در دو سري كاري متوالي ، خارج از محدوده  قرار گرفته كه با توجه به قانون  باعث رد سري دهم مي گردد.

به احتمال زياد يك خطاي سيستماتيك وجود دارد.

در سري يازدهم كاري كنترل با غلظت بالا ، خارج از محدوده 2 SD + قرار گرفته و احتمال اين خطا وجود دارد. چارت از نظر وجود قوانين  و   و  بررسي مي گردد. با توجه به عدم وجود 3 قانون نامبرده ، اين سري كاري قبول مي شود ولي بايد به هشدار توجه نمود.

در سري دوازدهم كاري در چارت هر دو كنترل دو خوانده متوالي در دو سري كاري متوالي خارج از محدوده قرار گرفته با اعمال قانون در هر دو غلظت مشاهده مي گردد كه 4 خوانده متوالي خارج از محدوده  وجود دارد. عليرغم وجود قانون  ، از آنجائيكه در سري دوازدهم هيچيك از نتايج ، خارج از محدوده 2 SD نيستند ، سري كاري تاييد مي گردد اما بايد احتمال وقوع يك خطاي سيتماتيك را در نظر داشت.

در سري چهاردهم كاري كنترل بالا خارج از محدوده +2 SD و كنترل ديگر خارج از محدوده -2 SD قرار گرفته پس با قانون  سري كاري رد مي شود.

به احتمال زياد يك خطاي راندوم وجود دارد.

در سري بيستم كاري بررسي نتايج در سريهاي قبلي نشان مي دهد كه 5 نتيجه در غلظت بالا و 5 نتيجه در غلظت پايين در يك طرف ميانگين قرار گرفته كه با قانون باعث رد سري بيستم مي گردد.

به احتمال زياد يك خطاي سيستماتيك وجود دارد.

قوانين WHO

در كتب مختلفي كه با موضوع تضمين كيفيت در آزمايشگاه توسط سازمان جهاني بهداشت چاپ گرديده است ، به روش هاي گوناگون تفسير چارتهاي كنترلي بر مي خوريد كه دو نمونه آن كه در دسترس مولفين اين مجموعه قرار گرفته با ذكر منبع ذيلاً آمده است :

Basic Quality assurance for intermediate and peripheral Laboratories (2002)

  • وقتي پراكندگي نتايج نزديك به ميانگين در اطراف آن باشد ، عملكرد سيستم قابل قبول است.
  • وجود يك خوانده خارج از محدوده  نشان مي دهد كه سيستم از كنترل خارج شده و براي يافتن خطا بايد اقدام فوري صورت گيرد.
  • هفت خوانده پياپي با سير صعودي يا نزولي (حتي اگر از ميانگين عبور كنند) نشانگر يك اتفاق تدريجي در سيستم بوده كه بايد شناسايي و اصلاح شود.
  • مشاهده يك سري از خوانده ها بطور پياپي و ثابت در يك طرف ميانگين نشانگر وجود bias مي باشد كه بايد شناسايي و اصلاح گردد.
  • پراكندگي زياد نتايج در اطراف ميانگين نشانگر دقت نامناسب اندازه گيري است كه نياز به اصلاح دارد.

Quality assurance in Hematology WHO/ LAB/ 1998

– يک خوانده خارج از محدوده                هشدار

– يك خوانده خارج از محدوده          غير قابل قبول (خطاي سيستماتيك يا راندوم)

– دو خوانده پياپي خارج از محدوده   غير قابل قبول (خطاي سيستماتيك)

– 4 خوانده متوالي خارج از محدوده  يا   غير قابل قبول (خطاي سيستماتيك)

– 6 خوانده متوالي يك طرف ميانگين                     هشدار (خطاي سيستماتيك)

توجه :

آزمايشگاه مي تواند بر اساس شرايط و سطوح کيفيت مورد نياز خود هر يک از روشهاي تفسير Levy Jenning، Westgard يا WHO را انتخاب نمايد.

يادآوري 15 :

به طور  معمول چارتهاي کنترلي هر ماه بازبيني و تمام مقادير معتبر براي محاسبه ميانگين و انحراف معيار ماه بعد لحاظ مي شود.

منظور از مقادير معتبر، مقاديري از کنتزل است که بر اساس روش تفسير بکار گرفته شده قابل قبول بوده و بر اساس آن نتايج بيماران گزارش شده است.

انواع خطا :

همانطور كه قبلاض گفته شد در شرايط معمول ، با تكارار آزمايش ، انتظار مي رود نتايج در دو طرف ميانگين پخش شده و پراكندگي مناسب داشته باشند (منحني سمت چپ a )

اگر نتايج به طور ثابت بيشتر يا كمتر از ميانگين ، قرائت شوند (منحني وسط b ) خطاي سيستماتيك رخ داده را كه در نتيجه آن ميانگين نتايج نيز تغيير مي يابد.

اگر عليرغم ثابت ماندن ميانگين ، پراكندگي نتايج افزايش يابد ، خطاي راندوم يا تصادفي اتفاق افتاده است . اين خطا با افزايش يافتن انحراف معيار مشخص شده و منحني بجاي شكل زنگوله اي ، نماي پهني پيدا مي كند (منحني سمت راست c )

خطاهاي ذكر شده در طول زمان روي نمودار زيرين نيز نمايش داده شده است.

اقدامات اصلاحي

صرف نظر از قوانين تفسير ، قوائت كنترل خارج از محدوده مورد انتظار ، بدين معناست كه نتايج بيماران از كيفيت مناسب برخودار نبوده و نبايد گزارش شوند. در اين حالت بايد مشكل را جستجو و آنرا برطرف نمود.

بسياري از مراجع علمي معتقدند در يك برنامه كنترل كيفيت كه بطور مناسبي طراحي شده ، بايد به محض مشاهده خطا ، عامل ايجاد آن را جستجو و پس از رفع ، اقدام به آزمايش مجدد كنترل نمود.

عليرغم اين موضوع اغلب ، به حجم رساندن مجدد يك كنترل تجاري و آزمايش آن ، اولين اقدامي است كه پس از مشاهده يك نتيجه نامناسب توسط آزمايشگاه صورت مي گيرد. چرا كه احتمال بروز مشكلاتي در خود كنترل تجاري مانند افت غلظت ؛ آلودگي ، تبخير يا مسائلي از اين دست وجود دارد. در مراحل بعدي با توجه به نوع خطا (راندوم يا سيستماتيك) ساير موارد ايجاد خطا در نظر گرفته و جستجو مي شود.

مثال هايي از عوامل ايجاد خطا به تفكيك نوع خطا ، ذيلا آمده است :

خطاي راندوم :

– دماي ناپايدار

– نوسانات جريان الكتريكي دستگاه قرائت كننده

– وجود حباب هوا در زمان انتقال نمونه يا معرف

– عدم رعايت حجم برداشتي از نمونه يا معرف

– عدم رعايت زمان انكوباسيون

– ناپايداري معرف

– عدم رعايت شرايط نگهداري نمونه

– آلودگي ظورف شيشه اي مورد استفاده ، نوك سمپلر و …

– آلودگي نمونه كنترلي ، معرف و …

– اشكال در سيستم قرائت كننده

– ….

خطاي سيستماتيك

– اشكال در كاليبراسيون مانند در نظر گرفتن ارزش نادرست براي كاليبراتور ، تهيه نامناسب ، آلودگي ، افت ، تغليظ ، تغيير شماره ساخت و …

– عوض كردن معرف بدون تغيير در كاليبراسيون

– تخريب تدريجي معرف

– عدم رعايت دستور العمل سازنده براي تهيه معرف

– تغيير در دماي انكوباسيون

– خطاي ثابت در وسايل انتقال دهنده نمونه يا معرف مانند سمپلر

-…

بايد در نظر داشت كه برخي مشكلات بوسيله آزمايشگاه قابل حل نبوده و لازم است به شركت پشتيبان دستگاه يا معرف اطلاع داده شوند.

چارت كنترلي تجمعي Cumulative Sum (Cusum) Control chart

Cusum روشي است كه جمع جبري اختلافات نتايج آزمايش نمونه كنترلي را با ميانگيني كه در ابتدا تعيين شده بود ، بررسي مي نمايد و به خطاهاي سيستماتيك حساس مي باشد. در شرايط معمول ، نتايج كنترل ها در اطراف ميانگين (بالاتر و پائين تر ) قرائت مي شوند اما اگر نتايج سير نزولي يا صعودي پيدا كنند ، جمع جبري اختلافات نتايج با ميانگين ، افزايش يافته و احتمال بروز خطاي سيستماتيك مطرح مي شود.

براي اجرا و تفسير چارت Cusum دو راه وجود دارد :

– V- mask

– محدوده تصميم گيري (decision limit)

از آنجائيكه روش محدوده تصميم گيري(decision limit) ، ساده تر بوده و قابليت اجراي كامپيوتري نيز دارد ، در اين دستور العمل راجع به اين روش توضيح داده مي شود.

1- كنترل را 20 بار آزمايش و ميانگين انحراف معيار آن را محاسبه نمائيد. (مطابق مراحل 1 تا 5 در بخش اجراي گام به گام كنترل داخلي كيفيت)

2- چارت كنترلي ترسيم نمائيد كه در آن محور y نشانگر Cusum و خط مركزي آن Cusum صفر (به منحني صفحه 56 توجه كنيد ) باشد.

3- براي تفسير Cusum بروش محدوده تصميم گيري  (decision limit) بايد دو محدوده را مشخص نمائيد.

 كه بطور معمول  در نظر گرفته مي شود.

 كه محدوده كنترل است و اغلب  براي آن در نظر گرفته مي شود.

4-  در هر سري كاري يك نمونه كنترل آزمايش و نتيجه ان را با محدوده  مقايسه كنيد ماداميكه نتيجه در اين محدوده قرار داشت Cusum را اجرا نكنيد. در اين مرحله علامتگذاري چارت انجام نمي شود.

5- به محض اينكه كنترل از محدوده  خارج شد ، اختلاف نتيجه مشاهده شده را با  يا  محاسبه نمائيد ( اين اختلاف در مثال زير بصورت  نمايش داده شده است). Cusum در هر سري از جمع جبري جديد  با جمع جبري قبلي  بدست مي آيد. عدد بدست آمده ، روي منحني علامتگذاري مي شود.

6- Cusum بر اساس شيب منحني پيگيري مي شود تا زمانيكه :

– جهت منحني عوض شود يعني علامت جبري از مثبت به منفي يا برعكس از منفي به مثبت تغيير يابد ، كه در اينجا شرايط تحت كنترل قرار گرفته است.

– مقدار جمع جبري از  و  فراتر رود كه در اين حالت شرايط از كنترل خارج شده است. لذا Cusum تا زمان شناسايي عوامل ايجاد خطا قطع مي گردد.

مثال :

آزمايشگاهي تري گليسريد را در نمونه كنترلي اندازه گيري نموده و ميانگين 100 و انحراف معيار 5 بدست آورده و مطابق موارد ذكر شده در بند 3 محدوده هاي كاري خود را محاسبه نموده است.

سپس در هر سري كاري ، نمونه كنترل را آزمايش و نتايج را در جدول 2-2 درج نموده است.

اختلاف هر روز با  يا  بصورت  و جمع جبري بصورت  نمايش داده شده است.

همانطور كه مشاهده مي شود در روز اول ، نتيجه كنترل 110 قرائت شده كه 5 واحد بيش از  (105) بوده است لذا Cusum شروع شده و اختلاف  بصورت 5+ نمايش داده شده است. روز دوم كنترل 100 خوانده شده كه 5 واحد كمتر از  (105) مي باشد پس مقدار برابر 5- جمع جبري (دو عدد داخل بيضي) و   صفر بدست مي آيد. هنوز علامت  عوض نشده پس Cusum ادامه مي يابد.

Cusum در دو حالت متوقف مي گردد :

– وقتي علامت  تغيير يابد . در روز ششم مثال فوق ، علامت  از مثبت به منفي تغيير يافته كه نشان مي دهد شرايط تحت كنترل در آمده است.

-وقتي مقدار  از حد  يا  خارج شود. مثال اين مورد روز شانزدهم است كه در آن  به 14 رسيده كه بيش از  يعني 5/13 است. در اين حالت شرايط از كنترل خارج شده است. پس بايد خطاهاي احتمالي شناسايي و رفع گردد.

 مثال فوق در منحني زير نيز نمايش داده شده است .

Cusum نسبت به چارت كنترلي Levy- Jenning حساسيت بيشتري نسبت به خطاي سيتماتيك دارد. اين برتري در مورد قوانين چند گانه وستگارد ، صادق نمي باشد زيرا قوانين مختلف وستگارد طوري طراحي شده اند كه خطاي سيستماتيك و راندوم را شناسايي نمايند.

كنترل كيفيت بر اساس نتايج ازمايش بيماران

مكانيسم هاي QC بر اساس نتايج بيماران اغلب بعنوان مكملي براي روش هاي معمول كنترل كيفيت ، طراحي مي گردند. اگر چه اين روش ها وقت گير بوده و مقاصد QC را بطور كامل تامين مي نمايند ، اما بعضا ً موفق به يافتن خطاهايي مي شوند كه در تكنيك هاي معمول QC قابل تشخيص نيستند.

براي اين امر نتايج هر بيمار بطور انفرادي و نيز نتايج يك گروه از بيماران مورد بررسي قرار مي گيرند.

1- نتايج هر بيمار به طور انفرادي

نتيجه آزمايش هر بيمار محصول نهايي عملكرد ازمايشگاه است ولي متاسفانه بررسي نتيجه تك تك بيماران شاخص حساسي براي شناسايي خطاها نمي باشد.

براي بررسي نتايج هر بيمار از روش هاي زير استفاده مي شود.

هماهنگي با علائم باليني

مقايسه نتايج آزمايشگاهي با علائم باليني بيمار در آزمايشگاه هايي كه تعداد زيادي از بيماران را پذيرش مي كنند ، تقريباً غير ممكن است. ضمن اينكه افراد در زمان ابتلا به بيماري واحد ، نتايج ازمايشگاهي يكساني نداشته و الزاماً هميشه علائم باليني با نتايج آزمايشگاهي هماهنگي كامل ندارد.

اين مشكلات ، ارزش اين روش را محدود به موارد واضحي مانند بدست آمدن بيلي روبين طبيعي در فرد مبتلا به ايكتر مي نمايد.

از آنجائيكه پزشكان بطور مرتب با اين مساله مواجه هستند ، بايد ترتيبي اتخاذ شود كه پزشكان ضمن همكاري نزديك با آزمايشگاه ، مشكلاتي از اين قبيل را به آزمايشگاه منتقل نمايند.

هماهنگي با ساير نتايج آزمايشگاهي

اگر يك گروه از آزمايشها در زمان و مكان واحد انجام شود ، مسئول آزمايشگاه مي تواند ارتباط انها را بررسي نمايد . مانند ارتباط ميزان TSH و T4

آزمايش هاي مضاعف (duplicate) در آزمايشگاه

براي اين كار نمونه ها در دو لوله ريخته شده و دوبار آزمايش مي شوند. اين روش در مواردي كه كنترل هاي پايدار تجاري در دسترس نمي باشند و يا بعنوان مكمل روش هاي معمول كنترل كيفيت كاربرد دارد.

با انجام آزمايش هاي مضاعف در يك ازمايشگاه مي توان عدم دقت نتايج را بررسي نمود اما اگر اين بررسي در دو آزمايشگاه انجام شود ، خطاي سيستماتيك نيز در آن دخيل و تفسير آن مشكل مي شود.

براي اين بررسي در يك ازمايشگاه ، تعدادي نمونه بصورت دوبل آزمايش ، اختلاف (d) آنها محاسبه و به توان 2 رسانده مي شود . سپس انحراف معيار اختلافات بر اساس فرمول زير بدست مي آيد.

هر جفت جوابي كه بيش از 2 SD با هم اختلاف داشته باشند غير قابل قبول شناخته مي شوند. مثال اين روش در بخش كنترل كيفيت در آزمايشهاي خونشناسي آمده است.

دلتا چك با نتايج قبلي

اگر نتايج جديد هر بيمار با نتايج قبلي مقايسه شود ، برخي خطاها مانند جابه جايي نمونه يا جواب ، شناسايي مي گردد. اساس اين روش بر اين موضوع استوار است كه مقادير آناليت ها در بدن يك فرد در مدت زماني مشخص ، در محدوده مشخصي تغيير مي كند. Ladenson دلتا چك را در مدت زماني 3 روز براي تعدادي از آناليت ها بررسي نموده كه در جدول 3-2 آمده است.

Limit checks

آزمايش بيماراني كه نتايج آنها در محدوده اي قرار گرفته كه با شرايط فيزيولوژيك منافات دارد بايد از نظر احتمال اشتباهات تايپي مانند قرار دادن مميز در محل اشتباه ، بررسي گردد. مقادير اين محدوده بستگي به متد مورد استفاده دارد.

مثال هايي از اين محدوده ها در جدول 4-2 آمده است.

جدول 4-2

2- كنترل كيفيت بر اساس نتايج بيماران متعدد

مطالعات آماري نتايج بيماران بصورت گروهي ، در تشخيص خطاهاي سيستماتيك (shifts and drifts) مفيد مي باشد اما توانايي شناسايي خطاهاي راندوم را نداشته و نمي تواند جايگزين روش هاي معمول كنترل كيفيت با مواد پايدار كنترلي گردد. مقادير حاصله از نتايج هر بيمار علاوه بر متغير هاي بخش آناليتيك ، تحت تاثير متغير هاي متعددي مانند شرايط دموگرافيك ، بيولوژيك و پر آناليتيك قرار دارد. اين مسئله باعث مي شود كنترل كيفيت بر اساس نتايج بيماران متعدد و محاسبه ميانگين نتايج آنها ، نسبت به بررسي نتايج انفرادي هر بيمار ارجحيت داشته باشد.

ميزان تغييرات ميانگين يك گروه بيمار با شاخص آماري انحراف معيار از ميانگين (Standard  error of mean) يا به اختصار SEM بيان مي شود كه خود حاصل تقسيم انحراف معيار نتايج يك گروه بيمار بر مجذور تعداد آنان مي باشد. بعبارتي هر چه تعداد بيماران مورد بررسي افزايش يابد ، ميانگين نتايج ، متحمل تغييرات كمتري خواهد بود.

مقادير ميانگين تابعي از مشخصات مراجعين به آزمايشگاه مانند نسبت زن به مرد ، نسبت بيماران بستري در بيمارستان ، ارجاع از كلينيك هاي تخصصي و همچنين متغير هاي پر آناليتيك مانند مدت بسته بودن تورنيكه و نحوه نگهداري نمونه مي باشد و با تغيير هر يك از اين موارد ، دستخوش تغيير مي شود. از آنجائيكه هيچ يك از اين پارامتر ها در برنامه هاي معمول QC با كنترل هاي پايدار قابل بررسي نيستند ، استفاده از نتايج بيماران مي تواند بعنوان مكملي مناسب براي ساير تكنيك هاي كنترلي ، استفاده گردد.

روش هاي آماري براي پايش ميانگين نتايج بيماران

يكي از راه هاي استفاده از نتايج بيماران ، محاسبه ميانگين نرمال average of normal (AON) يا  mean of normal است و همانطور كه از نام آن مشخص مي باشد ، از ميانگين نتايج نرمال بدست مي آيد. پس بايد ابتدا نتايج غير طبيعي را بر اساس محدوده مرجع حذف و سپس ميانگين را محاسبه نمود.

همچنين مي توان پس از گروه بندي افراد بر اساس شرايطT اقدام به محاسبه ميانگين نمود كه بنام weighted mean شناخته شده و شاخص حساس تري براي شناسايي خطاها خصوصاً براي تستهايي مانند اندازه گيري پروتئين و آلبومين مي باشد.

الگوريتم Bulls كه امروزه بطور گسترده اي براي پايش دستگاه هاي سل كانتر بكار مي رود ، از ميانگين متحرك (moving average) براي ارزيابي اندكسهاي خوني استفاده مي نمايد.

همانطور كه قبلا گفته شد بررسي ميانگين نتايج بيماران در فواصل زماني مشخص و مقايسه آن با نتايج قبلي در تشخيص خطاهاي سيستميك به آزمايشگاه كمك مي كند.

بررسي هماهنگي نتايج آزمايشگاه با علائم باليني

اين مطالعات اغلب بصورت گذشته نگر انجام شده و ميزان موارد منفي و مثبت كاذب نتايج آزمايشگاهي را بر اساس تشخيص نهايي بررسي مي نمايد. اين روش كيفيت نتايج آزمايشگاه را در دراز مدت ، كنترل مي كند.

3-5- كنترل كيفي اتوانالايزر

اتوميشن و تجزيه گر خودكار در آزمايشگاه بيوشيمي

اصطلاح اتوميشن در بيوشيمي باليني توصيف كننده ابزار هايي است كه بررسي بيوشيميايي كميت ها را با حداقل دخالت تكنولوژيست انجام مي دهد.

انواع تجزيه گر خودكار

تجزيه گرهاي خودكار بر اساس ماهيت ، معرف مورد استفاده به تجزيه گر هاي با معرف مايع و بدون معرف مايع مانند سيستم هاي Kodak Ektachem, Vitros , Opus تقسيم بندي مي شوند. سيستم هاي با معرف مايع در ايران رايجتر بوده و بهمين جهت در اين دستور العمل مورد بحث قرار گرفته اند.

ساختمان كلي تجزيه گرهاي خودكار با معرف مايع ، شامل قسمت هاي زير مي باشد :

منبع نوري ، منوكروماتور ، محفظه كووت ، انكوباتور براي ايجاد دماي مناسب واكنش ، بازوي مكنده معرف ، بازوي مكنده نمونه Sample / Reagent probe ، دتكتور و واحد اطلاعات و پردازش.

اين سيستم ها بر اساس روش انتقال نمونه به دو دسته Continuous- flow و Discrete Analyzer تقسيم مي شوند. در تجزيه گر هاي خودكار Continuous- flow نمونه از طريق بازوي مكنده نمونه Sample probe ) )   به جريان مدوام معرف وارد مي شود ولي در سيستم هاي Discrete نمونه توسط probe به محفظه واكنش خاص انتقال مي يابد.

نكات مهم در استفاده از تجزيه گر خودكار بيوشيمي

– آشنايي كامل با دستگاه قبل از شروع به كار

– ايجاد شرايط الزامي براي عملكرد صحيح دستگاه بطور مثال برق مناسب و يا آب با خلوص خاص

– استفاده از برنامه اختصاصي ارائه شده سازنده كيت براي دستگاه مورد استفاده

– عدم استفاده از كنترل به جاي كاليبراتور در عمل كاليبراسيون، در کاليبراسيون  كميت ها بايد به غلظت مناسب كاليبراتور نيز توجه داشت بطور مثال براي كاليبراسيون HDL مي بايد از كاليبراتور مخصوص همين كميت استفاده كرد نه از كاليبراتور كلسترول توتال.

– استفاده از كاليبراتور هاي مورد توصيه سازنده كيت يا استفاده از كاليبراتور و كنترل هاي هماهنگ

– عدم تغيير فاكتور اعلام شده سازنده كيت براي آنزيم ، اين عمل كه ممكن است به منظور تصحيح كنترل قرائت شده صورت گيرد مشكلات احتمالي از قبيل عدم كفايت ، ناپايداري معرف و امكان تداخل زمينه سرم كنترل با معرف و يا اشكال در دماي انكوباتور سيستم را پوشانده و مانع يافتن خطاي واقعي مي گردد.

نگهداري و كنترل كيفيت تجزيه گر خودكار

– براي حفظ كيفيت عملكرد تجزيه گر خودكار لازم است كليه موارد ياد شده در دستور العمل همراه جهت نگهداري و سرويس دستگاه رعايت گردد.

براي سرويس و كاليبراسيون سيستم برنامه زمانبندي شده تهيه و سوابق مكتوب اجراي آن نگهداري گردد.

– براي بررسي عملكرد دستگاه پس از هر سرويس و كاليبراسيون انجام تستها ي زير توصيه مي شود :

سنجش عملكرد پروبها : تستي انتخاب مي شود كه براي انجام آن كمترين حجم نمونه و بيشترين حجم معرف برداشت مي شود. مانند پروتئين در سيستم هاي RA. سپس يك نمونه كنترل 30 بار مورد اندازه گيري پروتئين قرار مي گيرد. پراكندگي نتايج حاصله بر حسب CV% نبايد بيش از مقدار خطاي مجاز اندازه گيري پروتئين و يا ميزان خطاي مجاز ادعا شده سازنده كيت باشد.

دماي انكوباتور : براي بررسي پايداري دماي انكوباتور دستگاه ، تستي انتخاب مي شود كه به تغييرات دما حساس است مانند اندازه گيري آنزيم ALT. سپس يك نمونه كنترل 30 بار مورد سنجش ALT قرار مي گيرد. پراكندگي نتايج حاصله بر حسب CV% نبايد بيش از مقدار خطاي مجاز ادعا شده توسط سازنده كيت باشد.

انتقال ناخواسته Carry Over : در دستگاه تجزيه گر خودكار ممكن است نمونه يا معرف بطور ناخواسته انتقال يابند.

براي بررسي انتقال ناخواسته معرف ، پيشنهاد مي گردد از دو تستي كه NADH را اندازه گيري مي نمايند ، استفاده شود . بطور مثال آزمايش هاي LDH و ALT كه يكي افزايش NADH و ديگري كاهش آنرا اندازه گيري مي كند.

بدين ترتيب كه بر روي يك نمونه كنترل در يك سري كار و به ترتيب زير ، 30 بار آزمايش LDH و 10 بار ALT انجام مي شود.

1. LDH

2. LDH

3. LDH- ALT

4. LDH

5. LDH

6. LDH-ALT

7.  ….

30. LDH-ALT

ميزان پراكندگي نتايج اندازه گيري LDH بر حسب CV اندازه گيري مي شود.

سپس در يك سري كاري 30 بار LDH به تنهايي (بدون همراهي با ALT ) اندازه گيري و پراكندگي نتايج حاصله بر حسب CV محاسبه مي شود.

CV% در حالت اول (آزمايش LDH و ALT ) بايد معادل يا كمتر از حالت دوم (اندازه گيري LDH به تنهايي)باشد.

انتقال ناخواسته نمونه با انجام آزمايش بر روي نمونه هاي با غلظت بالا و پايين كميت هاي انتخابي ، بطور متوالي بررسي مي شود. به طور مثال گلوكز با غلظت هاي 50 و 500 ميليگرم درصد و يا ALT در غلظت هاي بالا و پايين انتخاب شده بطور متوالي هر يك از نمونه هاي با غلظت پايين (L) و بالا  (H) سه بار مورد آزمايش قرار مي گيرند.

H-H-H-L-L-L-H-H-H-L-L-L-…

پراكندگي نتايج غلظت هاي پايين مورد محاسبه قرار مي گيرند.

سپس در يك سري كاري مجزا ، نمونه با غلظت پايين به تنهايي و به دفعات اندازه گيري و پراكندگي نتايج حاصله بر حسب CV% محاسبه مي شود.

پراكندگي بر حسب CV% در حالت اول نبايد بيش از پراكندگي حاصله از تكرار همين نمونه به تنهايي و در سري كاري مجزا باشد . در غير اين صورت تداخل در برداشت نمونه وجود داشته است.

– اجراي برنامه كنترل داخلي كيفيت Internal Quality Control براي كليه كميت هاي اندازه گيري شده با دستگاه جهت بررسي قابليت تكرار و عضويت در برنامه ارزيابي خارجي كيفيت EQAS جهت بررسي صحت عملكرد دستگاه تجزيه گر خودكار الزامي است.

– براي بررسي عملكرد تجزيه گر هاي خودكار مي توان به دستور العمل هاي ECCLS و CLSI رجوع نمود.

4-5- كنترل كيفيت در بخش هماتولوژي :

هر آزمايشگاهي بايد يك برنامه تضمين كيفيت داشته باشد. اين برنامه به صورت زمانبندي شده مي باشد :

– در هر زمان                 بازبيني تطابق جوابها  * گسترش خوني با شمارش سلول ها

*                                                  شمارش سلول ها با يافته هاي باليني

– هر روز                     آزمايش نمونه كنترل  * با هر سري كاري يك نمونه كنترل گذاشته شود

l                         رسم منحني كنترل

l                                                          تست هاي مضاعف

l                                                          تست هاي بازبيني

l                                                          دلتا تست

محاسبه ميانگين روزانه

– به فواصل روزانه يا هفتگي                    نظارت بر كاليبراسيون سل كانتر

– به فواصل مورد نياز                            كاليبراسيون پي پتها

– حداقل هر شش ماه                           منحني كاليبراسيون فتومتر و اسپكتروفتومتر

اكنون با اين مقدمه به شرح هر يك از تست ها مي پردازيم.

تست هاي مضاعف

روشي آسان براي كنترل دقت كار روزانه مي باشد . در صورتيكه كار روزانه اجازه دهد بايد نمونه را به صورت مضاعف آزمايش نمود و اگر به علت كثرت كار امكان ندارد حداقل 5-4 نمونه را به طور متوالي آزمايش نمائيد و سپس انحراف معيار تست ها را به صورت زير محاسبه نمايئد  d اختلاف بين دو تست مضاعف و n تعداد نمونه هاي آزمايش شده مي باشد. هيچكدام از آزمايش هاي مضاعف نبايد بيش از 2SD با هم اختلاف داشته باشد از اين رو خطاهائي كه به صورت منفرد (Random Error) وجود دارد مي توان شناسائي كرد. اگر آزمايش هميشه به صورت نادرست انجام گردد مقدار SD وسيع شده و نمي توان خطاي فردي را يافت.

مثال :

Rejectdشمارش بار دوماولين شمارشتعداد نمونه
 1641241201
 931511482
 2117   71131063
×289 1521694
 2551051005
 100101961866
 100101601707
 3661441508
 3661591659
 0013013010

نمونه شماره 4 قابل قبول نيست زيرا   45 ، 11 >  d است.

تست هاي بازبيني

اين تستها شبيه تستهاي مضاعف مي باشد ولي از نمونه هائي انجام مي شود كه قبلاً انجام شده اند. نتايج بايد حداكثر تفاوتي برابر  با هم مطابقت داشته باشند (در صورتيكه نمونه ها در شرايطي قرار گيرند كه تغيير نكرده باشند )در صورت تاخير بيش از 6 ساعت بين دو تست در حرارت آزمايشگاهي اين روش جهت هموگلوبين و نسبتاً WBC, RBC مناسب است ولي براي هماتوكريت مناسب نيست زيرا هماتوكريت پس از اين مدت كاهش پيدا مي كند از اين روش جهت شناسائي فساد معرف ها يا خرابي دستگاه ها مي توان استفاده نمود. تعيين انحراف از معيار شبيه آزمايش هاي مضاعف مي باشد. افزايش SD نشان دهنده خرابي دستگاه يا معرف ها مي باشد.

تست دلتا

اين تست براي مقايسه نتايج فعلي يك بيمار با نتايج اخير همان فرد مي باشد. در صورتيكه فرد سابقه بيماري يا درمان داروئي و تزريق خون داشته باشد اين تست مناسب نمي باشد. به علت تغييرات فيزيولوژيك دامنه اي براي تغييرات پارامتر هاي خوني در نظر گرفته مي شود كه به شرح زير است :

HGB                                        2gr/ dl PCV                                           0.05 MCV                                          > 6 fl MCH                                         > 5 pg WBC                   Normal to abnormal PLT                   Reduced or increased

بررسي داده هاي بيماران (Moving Average )

 n تعداد روز ها است كه در واقع n-1 همان 10 بايد باشد.

نتايج وقتي ارزش دارد كه افراد به صورت تصادفي مراجعه كنند مثلاً در روز هاي خاصي از كلينيكي مانند بيماران تالاسمي يا فقر آهن و ……… مراجعه ننمايند چرا كه ميانگين پارامتر ها در آن روز با بقيه روز ها تفاوت خواهد داشت. در اين صورت يا بايد محاسبات آن روز را از جدول كاري حذف نمود و يا به جاي ميانگين از ميانه استفاده كرد.

ميتوان براي اين نتايج منحني كنترل نيز رسم نمود. مانند مثال زير :

اندكس هاي ديگر مانند (HGB, RBC, PCV) به طور غير مستقيم كنترل مي شوند.

بازبيني تطابق جواب ها

منظور از بازبيني تطابق جواب ها اين است كه اگر جواب آزمايش دور از انتظار باشد بايد بررسي گردد كه آيا از نظر كلينيكي قابل توجيه است و يا آزمايشات قبلي بيمار قابل مقايسه و تفسير مي باشد. مثلا يك هموگلوبين بالا يا پائين ممكن است به علت تزريق خون يا خون ريزي باشد و يا يك MCHC  پائين بايد توسط اسمير خون محيطي مورد مطالعه قرار گيرد آيا هيپركروم و يا هيپوكروم است. يك MCV پائين بايد در اسمير خون محيطي ديده شود آيا ميكروسيت است. همچنين لكوسيتوز و لكوپني يا ترومبوسيتوز و ترومبوسيتوپني را مي توان توسط اسمير خوني مقايسه و مورد تأييد قرار داد ولي بايد توجه داشت كه اگر اسمير از كيفيت مناسب برخوردار نباشد ممكن است گمراه كننده باشد.

آزمون آماریT

مشخص شده است که چنانچه نسبت افزایش خون به ضد انعقاد EDTA متناسب باشد پارامتر های WBC هموگلوبین ،Hct و ایندکس ها در خون حاوی که در دمای 4درجه سانتیگراد نگهداری شده حداقل برای 24ساعت ثابت خواهد بود.

تعداد پنج نمونه یا ترجیحا 10 نمونه خون که مقادیر پارامتر های آن در محدوده طبیعی است به دستگاه داده و مقادیر آن یادداشت می شود . سپس آنها را در یخچال بیرون آورده و پس از آن یادداشت وی شود.این دو اندازه گیری برای پارامتر خونی به طور جداگانه با استفاده از آزمون آماری t(Students t test)و محاسبه tnبا هم مقایسه می شوند. اگر در بین دو جواب اختلاف معنی داری وجود داشته باشد،دستگاه از کالیبراسیون مجدد شود.

در فرمول فوق :

تعداد جفت های مورد آزمایش =n

میانگین اختلافات(روز به روز)= d

انحراف معیار اختلاف =SD

مقدار tn برای هر پارامتر خونی محاسبه شده و چنانچه مقدار tn محاسبه شده از مقدار بحرانی 95% محدوده اطمینان که در جدول آماری t یافت می شود فراتر رود اختلاف در سطح 5%معنی می شود.

مثال :تصدیق کالیبراسیون MCVبا آزمون آماری t

(میزان d )یا اختلاف روز به روزمیزانMCVروزدوممیزانMCVروزاولنمونه خون
42-82801
164961002
4270723
1161624
9385885

برای n=5 (جفت های موردآزمایش) مقدار tn بحرانی با توجه به جدول t برابر 78/2است. اگر میزان tn بیشتر ار 78/2 باشد می توان تا 95درصد اطمینان داشت که اختلاف معنی دار بین MCV دو روز وجود دارد.در صورت وجود یک t معنی دار باید اقدام به رفع اشکال آن پارامتر نمود.

در مثال فوق چون مقدار t کمتر از 87/2 است نتیجه گرفته می شود که دستگاه از کالیبراسیون خارج نشده است.

چارت كنترلي

منحني كنترل با محاسبه mean و  SD از يك خون كنترل رسم مي گردد. اين منحني را Levey & Jennings  مي نامند. با استفاده از كاغذ ميليمتري منحني را طوري رسم كنيد كه خط عمودي بيانگر مقدار پارامتر مورد نظر و خط افقي روز هاي كاري را نشان دهد. سپس خط ميانگين و خطوط  را به شكل افقي در دو طرف ميانگين مشخص كنيد.

به عنوان مثال فرض كنيد براي هموگلوبين ؛ mean=144.6       sd=3.3      2sd=6.6     بدست آمده است پس سه خط را به اين شكل رسم مي كنيم :

-2sd=138                  +2sd=150                  mean=144

با آماده شدن منحني هر روز كاري نمونه كنترل را به دستگاه داده و اعداد را روي منحني منتقل مي كنيم . براي تصميم گيري در مورد وضعيت دستگاه بايد از قوانين Westgard كمك گرفت. اين قوانين بدين قرارند :

– يك نمونه كنترل خارج از محدوده 

– يك نمونه كنترل خارج از محدوده 

– دو نمونه پي در پي خارج از محدوده

– دو نمونه متوالي بيش از 4sd فاصله داشته باشند

– چهار نمونه متوالي خارج از محدوده

– 10 نمونه متوالي در يك طرف خط ميانگين قرار بگيرد

قانون اول به منزله هشدار بوده و بقيه موارد منجر به رد نتايج ميگردد.

كنترل كيفي خارجي

اگر همه احتياطات لازم توسط كنترل كيفي داخلي جهت دست يافتن به يك نتيجه قابل اعتماد صورت گيرد خطاهائي ايجاد مي شود كه فقط از طريق كنترل كيفي خارجي مشخص مي گردد. به علاوه براي يكسان كردن نتايج بين آزمايشگاه ها و شناسائي خطاهاي سيستماتيك يك عمل ضروري است. در آزمايشگاه هماتولوژي تعداد بسيار كمي تست وجود دارد كه بتوان با چنان اطميناني به وسيله روش معين و مشخص انجام داد كه صحت آن در حد مطلوب باشد لذا هماهنگي بين آزمايشها منجر به يكسان شدن نتايج مي گردد. كنترل كيفي خارجي تمام آزمايشگاه ها را در محدوده اي كه از نظر باليني اهميت دارد يكسان نموده و آزمايشگاه هاي خارج از محدوده را تعيين مي نمايد. اساس كار بدين ترتيب است كه نمونه هاي يكسان از طرف ازمايشگاه مرجع براي آزمايشگاه ها فرستاده مي شودو آزمايشگاه ها نتايج خود را به آزمايشگاه مرجع ارسال مي نمايند. سپس اين نتايج به يكي از روش هاي زير مورد تجزيه و تحليل و تفسير قرار مي گيرند :

روش تطبيق دادن جوابها (Consensus Method )

در اين روش براي نتايج آزمايشگاه ها با استفاده از رابطه زير ، ميانگين و انحراف معيار محاسبه مي گردد.

تعداد ازمايشگاه ها =

نتيجه هر آزمايشگاه = x

ميانگين نتايج آزمايشگاه ها = x

سپس نتايجي كه خارج از محدوده ( ميانگين ) مي باشد حذف مي كنيم و ميانگين و SD مجدد تعيين مي نمائيم كه اكنون به نام Weighted ناميده مي شود. سپس از رابطه زير اندكس انحراف (Deviation Index) يا DI را براي هر آزمايشگاه تعيين مي نمائيم و به اندكس فوق Z-Score نيز مي گويند.

DI= (Actual Result – Weighted mean ) / Weighted SD

DI نشان دهنده اختلاف بين هر آزمايشگاه و ميانگين Weighted مي باشد. بدين ترتيب مي توان اختلاف عملكرد هر آزمايشگاه را با ساير ازمايشگاه ها تعيين نمود.

اگر پراكندگي نتايج انتشار غير گوسي و پهن داشت به جاي ميانگين از ميانه استفاده مي شود :

SD= median / 1.35

DI= (x-median ) / Weighted SD

در انتها امتياز DI براي هر آزمايشگاهي بدين ترتيب تفسير مي گردد :

DI < 1               آزمايش رضايت بخش انجام شده است.

DI=1-2             هنوز قابل قبول است ولي در حد مرز قرار دارد.

DI=2-3             نياز به مرور تكنيك و كاليبراسيون وجود دارد.

DI > 3              نقصي وجود دارد كه نياز به رسيدگي اورژانس دارد.

براي اينكه بتوان از اين روش استفاده نمود بايد حداقل 15 شركت كننده در هر بررسي وجود داشته باشد و حداقل نيمي از ازمايشگاه ها نتايج خوبي داشته باشند تا از بوجود آمدن يك SD Weighted غير مؤثر و محدوده وسيع نتايج جلوگيري نمود.

روش ارزش اختصاص داده شده Assign Vslue Method

وقتي مواد كنترلي ساخته مي شود مي توان ارزش واقعي آن را به وسيله متد قابل اطمينان و با مواد مرجع و طبق توصيه هاي بين المللي تعيين نمود و به عنوان پايه آن را قبول كنيم و دقت كار نيز به وسيله يك يا چند كارشناس با تجربه مورد تاييد قرار گيرد. بنابراين نتايج شركت كنندگان را مي توان با دامنه انحراف معيار از ميانگين اختصاص داده شده به شرح زير قضاوت نمود :

HB, RBC, PCV                 4%

MCV, MCH, MCHC                 5%

Platelet count               15%

Retic count by manual               30%

چه موقع بايد به كاليبراسيون سل كانتر اقدام نمود ؟

  • هر شش ماه يكبار
  • ابتداي راه اندازي
  • پس از هر بار تعمير و سرويس
  • قابل قبول نبودن نتايج كنترل كيفي روزانه
  • تعويض محلول ها در صورتيكه موجب تغيير مشخص در نتايج خون كنترل و نمونه بيماران گشته باشد

اصول کار

هر روز شمارش زمينه يا Back ground  دستگاه ارزيابي و در صورت امکان ثبت و نگهداري شود. بطور معمول شمارش زمينه هر دستگاه در کاتالوگ مربوطه آمده است ولي مقادير قابل قبول سازمان جهاني بهداشت به شرح زير مي باشند.

  • RBC:                <0/03×1012/l
  • WBC:                 <0/04×109/l
  • Haemoglobin:            <0/2g/dl
  • Paltelets:                 <5×109/l

تنظيم آناليزور ها و كنترل كيفي در خون شناسي:

 تفاوت بين خون كنترل و خون كاليبره :

خون كاليبره خوني است كه داراي شمارش گلبولي و پارامتر هاي دقيق بوده و دستگاه آناليزور روي آن مقادير تنظيم مي گردد. براي كاليبراسيون احتياج به نمونه هاي خون تازه است كه شمارش سلولي و پارامتر هاي ان توسط روش هاي مرجع بدست آمده است.

براي تنظيم آناليزور ها بايستي نمونه خون كاليبره شبيه خون بيماران باشد به اين مفهوم كه محلول فيكساتيو به نمونه اضافه نشده باشد.

خون كنترل خوني است كه كاليبراسيون آناليزور را روزانه تحت كنترل در مي آورد و زمانيكه از كاليبراسيون خارج گردد ايجاد علامت خطا در چارت كنترل مي كند.

خون كنترل را مي توان از خون فيكس شده يا با مخلوط لاتكس در اندازه هاي مختلف معادل حجم هاي گوناگون سلولي يا حتي از مخلوط فيكس شده گلبول قرمز هسته دار خون محيطي بوقلمون به عنوان گلبول سفيد و گلبول قرمز انسان به عنوان گلبول قرمز استفاده كرد.

خون هاي كنترل پايدار بوده و اپراتور را قادر مي سازد كه نوسانات روزانه دستگاه را ثبت كند. كنترل كيفي روزانه با گراف لوي جنينگ و كيوسام احتياج به خون كنترل فيكس شده دارد.

در حالي كه كنترل كيفي روزانه با چارت t و چارت مضاعف و ميانگين متحرك بول نيازي به خون فيكس شده نداشته و با نمونه بيماران كاليبراسيون آناليزور بررسي مي شود.

اگر امكان تهيه خون كاليبره نبود چگونه آناليزور خود را كاليبره كنيم ؟

در اين حالت مي توان از يك آزمايشگاه مطمئن با آناليزور كاليبره 5 نمونه خون تازه كه به دستگاه داده اند انتخاب كرد و پارامتر ها و شمارش سلولي نمونه ها را به عنوان مرجع فرض كرد و آناليزور خود را تنظيم كرد. در اين گونه موارد مي توان حتي نمونه هاي خون تازه جهت كاليبراسيون از شهرستاني ديگر كه داراي آناليزور كاليبره است تهيه كرد و نمونه ها را در ظرف خنك به محل آزمايشگاه خود منتقل كرد. براي مثال شهرستان مجاور مركز استان مي تواند چند نمونه خون تازه از آزمايشگاهي مطمئن در مركز استان تهيه كند و مقادير CBC اين نمونه ها را به عنوان مرجع فرض كند.

نكته ديگر اينكه تنظيم دستگاه روي مقادير صحيح بايستي با استفاده از خون تازه و غير فيكس شده باشد ولي براي كنترل روزانه كاليبراسيون دستگاه مي توان از خون كنترل فيكس شده استفاده كرد.

روش هاي كاليبراسيون سيستم هاي شمارشگر و كنترل كيفي چگونه است ؟

براي اين كه دستگاه هاي خودكار گزارش صحيح از CBC ارائه دهند ، احتياج به كاليبراسيون دقيق دارند. قبل از اقدام به كاليبراسيون بايد اطمينان حاصل كرد كه تمام قسمت هاي دستگاه بطور صحيحي كار مي كنند و نقصي در دستگاه وجود ندارد. نخست بايد دقت دستگاه را بررسي كرد زيرا تا زماني كه يك اناليزور قابليت تكرار پذيري نتايج يك CBC را نداشته باشد نمي تواند كاليبره شود. بنابراين در مرحله نخست بايد قابليت تكرار پذيري نتايج آناليزور را ارزيابي كرد و براي اين كار يك نمونه خون را چندين بار پشت سر هم به دستگاه داده و تغييرات آن در مورد نتيجه هر پارامتر ارزيابي مي شود.

راه هاي گوناگوني جهت كاليبراسيون دستگاه وجود دارد كه هر كدام داراي مسائل مربوط به خود است.

تعدادي از كاليبره كننده هاي تجاري وجود دارد ولي چون اكثرا داراي فيكساتيو هستند ، انعطاف پذيري سلول ها را تغيير داده و از اين رو نمي توانند مانند يك گلبول تازه براي كاليبره كردن پارامتر هايي مانند MCV عمل كنند . روش هاي دستي كاليبراسيون هنوز از روش هاي مرجع براي كاليبراسيون دستگاه است. براي كاليبراسيون دستگاه بايد نمونه خوني را داراي مقادير CBC شناخته و دقيق است به دستگاه داد و روي آن مقادير ، دستگاه را تنظيم كرد.

يكي از روش هاي كاليبراسيون انتخاب 10 و ترجيحاً 20 خون تازه است ، هر كدام از نمونه ها را سه بار به دستگاه داده و سه بار هم به روش دستي براي هر پارامتر تعيين مقدار مي كنيم ، تعيين مقدار به روش دستي بايد با استفاده از روش هاي مرجع باشد. با روش دستي و دستگاهي CBC را انجام داده و براي پارامتر هاي هر نمونه خون مطابق رابطه زير يك فاكتور تصحيح بدست مي آيد.

100 ×ميانگين حاصل از روش دستگاهي – ميانگين حاصل از روش دستي = (فاكتور تصحيح) CF

                             ميانگين حاصل از روش دستگاهي

يك فاكتور تصحيح مثبت نشان مي دهد كه نتايج بدست آمده از دستگاه اتوماتيك پايين تر از روش دستي است و فاكتور تصحيح منفي بيانگر آن است كه نتيجه دستگاه اتوماتيك بالاتر از روش دستي مرجع است. از 10 يا 20 نمونه خون ، 10 تا 20 فاكتور تصحيح براي هر پارامتر مانند , MCV, Hct, Hb, RBC ،WBC, MCHC و … به دست مي آيد. ميانگين فاكتور هاي تصحيح براي هر پارامتر را حساب كرده و از آن براي تنظيم دستگاه استفاده مي كنيم.

مثال : براي كاليبراسيون پارامتر هموگلوبين ، 5 نمونه خون را هر كدام سه بار با روش دستي مرجع و روش فاكتور تصحيح را براي هر نمونه طبق فرمول زير محاسبه مي كنيم :

ميانگين روش دستگاهيميانگين روش دستيروش دستگاهي بار سومروش دستگاهي بار دومروش دستگاهي بار اولروش دستي بار سومروش دستي بار دومروش دستي بار اول 
5/145/155/141415155/1516نمونه اول
162/165/165/15168/151617نمونه دوم
5/112/115/1112115/101112نمونه سوم
2/145/145/1414146/141514نمونه چهارم
4/9102/991010911نمونه پنجم

100 ×  ميانگين حاصل از روش دستگاهي – ميانگين حاصل از روش دستي  =  CF

                           ميانگين حاصل از روش دستگاهي

ميانگين فاكتور تصحيح

ميانگين فاكتور تصحيح براي هموگلوبين در مثال فوق 8/2 درصد است و چون علامت آن مثبت است به مفهوم آن است كه دستگاه 8/2 درصد كمتر از روش دستي هموگلوبين را گزارش مي كند . بنابراين بايد 8/2 درصد Hb آن را افزايش داد. براي مثال اگر Hb يك نمونه خون را دستگاه 16 گرم درصد گزارش كند ، آن را به 4/16 تغيير داده و دستگاه را روي اين مقدار تنظيم مي كنيم يا فاكتور هموگلوبين دستگاه را 8/2 درصد بالا مي بريم.

4/0= 8/2% ×16

4/16= 4/0 +16

اگر ميانگين فاكتور تصحيح 8/2- درصد بود ميزان هموگلوبين دستگاه را 8/2 درصد كاهش مي داديم و آن را روي 6/15 گرم درصد تنظيم مي كرديم در مثال فوق :

6/15= 4/0 -16

مثال دوم :

اگر ميانگين فاكتور تصحيح WBC عدد 5%+ باشد بايستي WBC دستگاه را 5 درصد افزايش داد. براي مثال اگر WBC يك نمونه خون براي مثال 8000 در ميلي متر مكعب گزارش گردد، آناليزور را در سطح عدد 8400 تنظيم كرده و يا فاكتور كاليبره WBC را 5 درصد افزايش مي دهيم و از اين پس دستگاه براي WBC كاليبره است.

400= 5% × 8000

8400 = 400 + 8000

مثال سوم :

اگر ميانگين فاكتور تصحيح براي MCV برابر %3- باشد بايد MCV دستگاه را 3 درصد كاهش داد. براي مثال اگر MCV يك نمونه خون 70 فمتوليتر گزارش شود ميزان MCV روي عدد 68 تنظيم كرده و يا فاكتور MCV دستگاه را 3% كاهش مي دهيم و از اين پس دستگاه براي MCV كاليبره است.

2 = 3% × 70

68 = 2- 70

انتخاب روش هاي مرجع براي تعيين مقدار CBC به روش دستي

همان طور كه مطرح گرديد دستگاه شمارشگر سلولي بايد با حداقل 10 نمونه خون كه هم با روش دستي و آناليزور مربوطه تعيين مقدار شده اند كاليبره گردد. در واقع مقادير بدست آمده از روش هاي دستي به عنوان پايه براي كاليبراسيون قرار مي گيرد. براي بدست آوردن مقادير CBC به روش دستي بايد روش هاي معتبر و مرجع را انتخاب كرد.

روش مرجع اندازه گيري هموگلوبين

كميته بين المللي استاندارد هماتولوژي (ICSH) اندازه گيري هموگلوبين به روش سيان مت هموگلوبين (سيانور هموگلوبين) را روش مرجع قرار داده است. اين روش اندازه گيري داراي سه مزيت به شرح زير است :

1- تمام انواع هموگلوبين ها از قبيل مت هموگلوبين ، كربوكسي هموگلوبين ، اكسي هموگلوبين به جز سولف هموگلوبين (SHb) كه به مقدار ناچيزي در خون وجود دارد همگي به سيانومت هموگلوبين تبديل مي شوند ، البته سرعت تبديل كربوكسي هموگلوبين به سيانومت هموگلوبين در مقايسه با بقيه كمتر است.

2- استاندارد هاي پايدار سيان مت هموگلوبين با مقادير مشخص هموگلوبين به صورت تجارتي موجود است.

3- ماكزيمم جذب نوري سيان مت هموگلوبين در طول موج 540- نانومتر به صورت يك باند نسبتا پهن و صاف است و از اين رو اندازه گيري Hb با اسپكتروفتومتر يا كالريمتر قابل اعتماد است.

مواد لازم براي ساختن محلول درابكين

1- فري سيانور پتاسيم (Potassium Ferricyanide )  با وزن مولكولي 24/392 گرم.

2- سيانور پتاسيم (KCN) با وزن مولكولي 11/65 (احتياط : بسيار سمي)

3- داي هيدروژن پتاسيم فسفات  با وزن مولكولي 13/136 گرم

4- دتر جنت (پاك كننده) مناسب مانند استروكس SE يا تريتون  100-X

طرز تهيه محلول درابكين

2/0 گرم                                                   

05/0 گرم                                                  KCN

14/0 گرم                                                

Sterox SE/or                                                            

5/0 تا يك سي سي                                       (Triton X-100)

CC1000 سي سي                                       آب مقطر

محلول فوق در دماي 25-4 درجه در شيشه قهوه اي بوروسيليكات براي چندين ماه پايدار است.

با وجود داشتن سيانور محلول فوق نسبتا بي ضرر است (مصرف 4 ليتر آن مرگ زا است).

محلول درابكين بايد صاف و زرد و روشن باشد و جذب نوري آن در طول موج 540 نانومتر با شاهد آب مقطر صفر شود.

ميزان PH آن بين 4/7-7 بوده و توصيه مي شود كه PH آن به طور منظم حداقل ماهي يك بار با پ هاش متر (PH-meter) كنترل شود.

محلول درابکين در موراد زير بايد دور ريخته شود:

1- PH خارج از محدوده 4/7 – 7 باشد.

2- جذب نوري آن در طول موج 540 با شاهد آب مقطر عددي غير از صفر باشد.

3- كدر شدن محلول

4- چنانچه به طور اتفاقي منجمد شود ، موجب از هم پاشيدگي تركيبات آن مي شود.

مزيت محلول درابكين با فرمول فوق

الف- استفاده از  باعث كاهش PH محيط و تسريع واكنش ها شده و مي توان بعد از سه دقيقه از مخلوط كردن خون با محلول درابكين ميزان Hb را اندازه گيري گرفت.

ب- محلول پاك كننده غير يوني به هموليز گلبولهاي قرمز سرعت داده و موجب كاهش كدورت ناشي از ليپوپروتئين ها و غشاي گلبول ها مي شود.

روش انجام آزمايش

1- نمونه خون را كاملا مخلوط كرده و سپس 02/0 سي سي با پي پت سالي (Sahli pipette) برداشته و به 5 سي سي محلول درابكين اضافه كنيد تا رقت 251 : 1 بدست آيد. پي پت سالي را چندين بار در محلول آبكشي كنيد.

2- جذب نوري دستگاه اسپكتروفتومتر را با آب مقطر يا محلول درابكين در طول موج 540 نانومتر صفر كرده و سپس جذب نوري محلول تست و استاندارد را به دست آوريد.

غلظت استاندارد × جذب نوري تست  

     =   غلظت تست بر حسب گرم درصد

         جذب نوري استاندارد

نكته : براي به دست آوردن غلظت استاندارد بر حسب گرم درصد ميزان mg% كه روي ويال استاندارد درج شده است در عدد 1000 : 251  ضرب كنيد و چنانچه بر حسب گرم gr% باشد نيازي به محاسبه ندارد. ضريب 251 نسبت رقت و 1000 در مخرج كسر براي تبديل ميلي گرم به گرم است. اگر غلظت استاندارد mg% 60 باشد.

 غلظت استاندارد = غلظت استاندارد بر حسب گرم درصد

اندازه گيري هماتوكريت يا حجم فشرده (PCV) به روش ميكرو هماتوكريت

نسبت درصد حجم گلبول هاي قرمز فشرده به كل حجم خون را حجم فشرده گويند. براي انجام تست هماتوكريت خون را در يك لوله موئين 75 ميليمتري دهانه 2/1 ميلي متر كشيده حدود 15-10 ميلي متر خالي گذاشته مي شود. انتهاي لوله را توسط خمير با سطح صاف مسدود كرده و به مدت 5 دقيقه در سانتريفيوژ ميكروهماتوكريت با شتاب ثقل بالا (g 15000- 10000) سانتريفيوژ مي شود. حجم فشرده (PCV) با استفاده از خط كش يا ابزار درجه بندي مخصوص قرائت مي شود.

براي بدست آوردن حجم فشرده ، خون موجود در لوله موئين را معادل 100% فرض كرده و سپس درصد حجم گلبول هاي قرمز فشرده را از ير لايه بافي كوت قرائت مي شود.

كميته بين المللي استاندارد سازي در هماتولوژي زمان سانتريفيوژ كردن را 5 دقيقه براي خون هاي معمولي و براي نمونه هاي پلي سيتمي  (پرخون) 3 دقيقه ديگر افزون بر 5 دقيقه استاندارد توصيه مي كند.

حجم فشرده را مي توان با استفاده از خون وريدي با ضد انعقاد EDTA در لوله كاپيلاري ساده و يا از خون سرانگشتي با استفاده از لوله هاي كاپيلاري كه با 2 واحد هپارين (2 IU) آغشته اند ، انجام داد.

منابع مهم خطا در اندازه گيري حجم فشرده گلبول قرمز (PCV) :

1- استفاده از ضد انعقاد EDTA  حتي در مقدار طبيعي باعث چروكيدگي اندك گلبول هاي قرمز و 3% كاهش در هماتوكريت مي گردد ، از اينرو استفاده از EDTA  توصيه مي گردد.

2- افزايش غير متناسب هر نوع نمك EDTA نسبت به حجم خون باعث چروكيدگي گلبول ها و كاهش هماتوكريت مي گردد.

3- آن دسته از تغييرات شكل كه موجب كاهش خاصيت انعطاف پذيري (Flexibility) گلبول هاي قرمز مي شوند ، مانند كم خوني داسي شكل و اسفروسيتوز به علت اين كه حين سانتريفيوژ مقدار زيادي از پلاسما لابلاي گلبول هاي قرمز به دام مي افتد مقدار هماتوكريت را به طور كاذب افزايش مي دهند. در آنمي داسي شكل چنانچه تمام گلبول هاي قرمز داسي شوند ميزان پلاسماي به دام افتاده ممكن است حتي به 20 درصد برسد. پلاسماي به دام افتاده همچنين در كم خونيهاي ماكروسيتيك ، تالاسمي و كم خوني هاي هيپوكروم افزايش داد.

4- ماندن خون به مدت زياد در حرارت آزمايشگاه موجب ورم كردن گلبول هاي قرمز و كاهش انعطاف پذيري و افزايش هماتوكريت مي شود.

5- ميكروسيتوز با افزايش ميزان پلاسماي به دام افتاده هماتوكريت را افزايش مي دهد.

6- در حالت نرمال ميزان پلاسماي به دام افتاده معادل 3% هماتوكريت در نظر گرفته شده و مي توان ميزان هماتوكريت را براي پلاسماي به دام افتاده تصحيح كرد. مثلا اگر هماتوكريت بيماري 47% باشد ميزان واقعي هماتوكريت برابر است با :

حجم پلاسماي به دام افتاده                    41/1 = 3% × 47%

ميزان هماتوكريت واقعي                     %6/45- 41/1 – 47%

چنانچه هماتوكريت براي پلاسماي به دام افتاده تصحيح نشود موجب افزايش كاذب MCV و MCHC خواهد شد.

شمارش گلبول هاي قرمز و سفيد :

شمارش گلبول هاي قرمز و سفيد را مي توان با استفاده از آناليزور هاي تك كاناله و نيم اتوماتيك مانند كولتر مدل ZM را كه قادر است گلبول ها را در حجم ثابتي از خون رقيق شده مورد شمارش قرار داده و احتياج به كاليبراسيون ندارد مورد شمارش قرار داد.

در صورت عدم دسترسي به سلول شمار تك كانالي يا دستگاه هاي ديگر اتوماتيك يا نيم اتوماتيك مطمئن و كاليبره شده چاره اي جز استفاده از روش شمارش دستي با هموسيتومتر نيست.

هر نمونه بايد حداقل سه بار مورد شمارش قرار داد و ميانگين شمارش را به دست آورد.

نتايج روش هاي دستي از تكرار پذيري خوبي برخوردار نيستند ولي وقتي كه به عنوان تنها روش كار مطرح باشد بايستي رعايت تمام نكات از قبيل به كار گرفتن ملانژور سالم ، هموسيتومتر سالم و لامل مخصوص شمارش را جهت خطاي شمارش مد نظر قرار داد و نهايتا مي توان از يك آزمايشگاه كه كاليبراسيون آناليزور مورد اطمينان است 5 تا 10 نمونه خون كه آزمايش CBC روي آنها انجام شده انتخاب و مقادير تعيين شده را به عنوان اعداد مرجع قرار داد و دستگاه را با محاسبه فاكتور تصحيح كرد.

چنانچه شمارش سلولي نمونه هاي خون با روش دستي يا آناليزور هاي تك كاناله انجام گرفته باشد با استفاده از رابطه هاي زير اقدام به محاسبه اندكس ها مي شود.

                                                             

شمارش پلاكت :

امروزه شمارش صحيح پلاكت ها تنها با دستگاه هاي پيشرفته اتوماتيك امپدانس يا اپتيك ميسر است. منابع خطاي فراواني در رابطه با شمارش پلاكت ها با روش دستي وجود دارد.

تمايل پلاكت ها براي چسبيدن به همديگر و به شيشه و نيز اندازه كوچك آن ، كه با ذرات ديگر اشتباه مي شود ، شمارش دستي آن را مشكل ساخته است. استفاده از اگزالات آمونيوم به عنوان رقيق كننده كه گلبول هاي قرمز را پاره مي كند شمارش دقيق تري از پلاكت را نسبت به استفاده از فرمل سيترات (Formol-Citrate) كه گلبول هاي قرمز را در محيط باقي مي گذارد به دست مي دهد. با استفاده از رنگ برليان كريزل بلو مي توان پلاكت ها را در هموسيتومتر تا حدي به رنگ آبي درآورد و شناسايي آنها ساده تر كرد. سفارش مي شود كه شمارش پلاكتي دستگاه با تخمين شمارش از روي گستره محيطي خون EDTA دار همراه شود.

كنترل كيفي :

مراقب از روش هاي آزمايشگاهي به منظور كنترل جنبه هاي مختلف روش هاي آزمايش با اندازه گيري هاي روزانه خون شاهد و بررسي آماري اطلاعات به دست آمده ، كه دقت و قابليت تكرار پذيري را ارزيابي مي كند ، كنترل كيفي داخلي را تشكيل مي دهند.

كاليبراسيون شمارشگر هاي خودكار بايد با خون كنترل مورد بررسي قرار گيرد تا چنانچه دستگاه از كاليبراسيون خارج شده باشد مجددا اقدام به كاليبراسيون كرد.

نمونه خون كنترل يا به صورت تجاري در دسترس بوده و يا اين كه هر آزمايشگاهي مي تواند آن را تهيه نمايد. از خون كنترل مي توان روزانه استفاده كرد و چنانچه محدوده جواب هاي خون كنترل تعيين شده باشد مي توان با استفاده از نمودار كنترل كيفي و ثبت روزانه مقادير خون كنترل ، نمودار را بررسي كرد كه آيا جواب ها در محدوده  است ؟ آيا الگوي گرايش نتايج به يك طرف (Shift , trend) وجود دارد يا خير ؟ آيا با خطاي اتفاقي روبرو هستيم يا سيستميك؟

كنترل كيفي داخلي (Internal Quality Control) و تصديق كاليبراسيون

كنترل كيفي داخلي به طور اوليه دقت و تكرار پذيري ازمون هاي روزانه را تحت كنترل مي گيرد. كنترل كيفي داخلي بر اساس ارزيابي نتايج روزانه كنترل و به كار بردن يك سري قوانين كنترل كيفي صورت مي گيرد كه بعضي از آنها حساس به خطاهاي راندوم و برخي به خطاهاي سيستميك است.

متداولترين و سريعترين تجزيه و تحليل آماري نتايج ، استفاده از نمودار كنترل كيفي (Quality Control Chart)  است. معمولا خطاها شامل دو نوع است :

الف- خطاهاي راندوم يا غير قابل پيش بيني (Random errors)

ب- خطاهاي سيستميك

خطاهاي راندوم ممكن است براي مثال در اثر نوسانات غير قابل كنترل در درجه حرارات ، ولتاژ ظروف حجمي و طول موج و از اين قبيل موارد ايجاد شود.

خطاهاي راندوم به صورت پراكنده رخ مي دهند و ممكن است به طرف مثبت يا به طرف منفي ميانگين به مقادير متفاوت وجود داشته باشد.

خطاهاي سيستميك غالبا به علت عملكرد غلط دستگاه رخ مي دهد ، به طور مثال اگر رقيق كردن خون توسط شمارشگر از صحت خوبي برخوردار نباشد و يا اين كه از مواد فاسد (مثلا معرف هاي فاسد) استفاده شده باشد و يا اينكه روزنه دستگاه به تدريج با مواد پروتئيني نيمه مسدود شده باشد. خطاهاي سيستميك معمولاً نتايج خون را به يك طرف سوق مي دهند.

دقت (Percision)

تكرار يك آزمايش بر روي يك نمونه تحت شرايط يكسان به ندرت به جواب هاي يكسان مي رسد و معمولا نتايج حاصله پراكنده هستند. سنجش پراكندگي جواب ها با محاسبه انحراف معيار به دست آورده مي شود. چنانچه نتايج تكراري يك آزمون تحت شرايط يكسان به هم نزديك باشد گفته مي شود كه جواب ها از دقت خوبي برخوردار است.

صحت (Accuracy)

نزديك بودن نتايج به دست آمده به مقدار واقعي گفته مي شود.

تعيين محدوده اطمينان

چنانچه ميانگين و انحراف معيار پارامتر هاي خون كنترل از قبل مشخص نباشد ، حداقل بيست بار از روي آن پارامتر هاي گوناگون CBC را با يك آناليزور كاليبره تعيين مقدار كرده و ميانگين و انحراف معيار را محاسبه مي كنيم. در آزمايشگاه به صورت روزمره اين پيش فرض گذاشته مي شود كه نتايج بدست آمده داراي پراكندگي نرمال يا گوسي (Gaussian) است.

كنترل كيفي در شمارش رتيكولوسيت

جمع آوري و ذخيره سازي نمونه

– نمونه خون كامل در EDTA (مي تواند  يا Na2 باشد) با غلظت نهايي 1.5- 2.2 mg/ml قابل قبول مي باشد.

– آزمايش رتيكولوسيت بايد سريع انجام شود. در دماي اطاق تا 6 ساعت پس از نمونه گيري فرصت انجام ازمايش وجود دارد. نمونه هاي ذخيره شده در يخچال ممكن است تا 72 hr پايدار باشند. و البته اين در صورتي است كه در نمونه خون ، هموليز مشاهده نشود و شمارش  پايدار باشد.

محلول هاي رنگ آميزي

– جهت رنگ آميزي از رنگ هاي فوق حياتي (بريليانت كرزيل بلو ، نيو متيل بلو 1%) استفاده گردد.

– بعد از تهيه محلول رنگ آميزي ، محلول بايد در طول 24 hr روي شيكر مخلوط شود ، اين محلول در ظروف شيشه اي قهوه اي رنگ در  نگهداري مي شود (در اين حالت نيمه عمر رنگ يك ماه است).

– قبل از استفاده از رنگ بايد آنرا فيلتر كرد (بوسيله Filter Paper ).

تهيه اسمير

مخلوط رنگ و خون (نسبت 1 به 1) به مدت 10 -3 دقيقه در دماي اطاق بماند سپس اسمير تهيه مي شود.

درست قبل از تهيه اسمير نمونه به دقت مخلوط شود. شرايط كشيدن اسمير همانند اسمير هاي خون محيطي است.

روش شمارش

– از عدسي (LPF)10 جهت بررسي توزيع يكنوخت  استفاده شود.

– چنانچه توزيع يكنواخت باشد با كمك عدسي 100 (روغني ) در ناحيه مناسب گسترش شمارش آغاز شود.

يادآوري 15:

– گلبول هاي قرمزي ، رتيكولوسيت محسوب مي شوند كه حداقل 2 گرانول آبي روشن داشته باشند.

منابع خطا

– رسوب رنگ يا ساير انكلوژنهاي RBC

– شمارش در نواحي غير يكنوخت گسترش

– بالا بودن غلظت EDTA ، هايپرگلايسمي و استفاده از ضد انعقاد هپارين

– عدم اصلاح كم خوني  در خونريزي ها و آنمي هاي شديد ، كه بايد شمارش رتيكولوسيت اصلاح شده (C.R) و انديكس رتيكولوسيت (RPI) مد نظر قرار گيرد.

(فرد بيمار )P=Patient  ، (فرد نرمال)N=Normal   ، (رتيكولوسيت اصلاح شده) C.R=Corrected Retic

درصد رتيكولوسيت %R= ، (انديكس توليد رتيكولوسيت) RPI=Retic Product Index، هماتوكريت HCT=

(زمان بلوغ رتيكولوسيت در خون محيطي بر حسب روز )M.T=Maturation Time

توضيحات

براي افتراق انكلوژنها از رتيكولوسيت بايد به نكات زير توجه نمود :

– اجسام پاپن هايمر ، با رنگ آميزي آهن(Perls’ Prussian blue) نيز مشاهده و تشخيص داده مي شوند.

– اجسام هاول جولي بادي ، آبي قرمز يا بنفش پر رنگ بوده و با رنگ هاي رومانوفسكي نيز مشاهده مي شوند.

– هموگلوبين H ، بصورت يكدست (توپ گلف) در  مشاهده مي شوند.

– اجسام هاينز ، براي افتراق اين اجسام از رتيكلوسيت ، لام رتيكلوسيت را با الكل فيكس كرده سپس با رنگ هاي رومانوفسكي رنگ آميزي مي كنيم اين امر باعث بي رنگ شدن اجسام مذكور و مشاهده رتيكلوسيت به تنهايي مي گردد.

– انكلوژن هاي بازوفيليك استيپلينگ ، با رنگ هاي رومانوفسكي نيز ديده مي شوند و حتي مي توان درصد آنها را مشخص كرده و از شمارش رتيكلوسيت كم نمود.

كنترل كيفي دستگاه ميكروسانتريفيوژ :

سرعت سانتريفيوژ مي بايست با تاكومتر و زمان سنج دستگاه با كرونومتر ارزيابي گردد.

در صورت عدم اجراي موارد بالا (ارزيابي عملكرد مستقيم دستگاه) از روش غير مستقيم كاليبراسيون استفاده مي شود. اين روش توسط سازمان بهداشت جهاني براي بررسي توان دستگاه توصيه شده و به روش زير انجام مي شود :

چند نمونه خون با هماتوكريت كمتر از 50 را انتخاب نموده و پس از 20 بار سروته نمودن بصورت دوتايي به مدت 3 ، 5 ، 7 ، 9 و 11 دقيقه سانتريفيوژ كرده و نتايج ثبت مي شود. در صورت مناسب بودن توان دستگاه (g) نتايج حاصله از دقيقه 5 به بعد مي بايست بدون تغيير باقي بماند.

كنترل كيفي خط كش ميكروهماتوكريت :

در صورت استفاده از خط كش جهت كنترل كيفي ، لوله هماتوكريت را روي خط كش قرار داده به نحوي كه ابتداي      ستون گلبول هاي قرمز روي صفر خط كش و انتهاي ستون سلول و پلاسما در حد 5 سانتي متر قرار گيرد. در اين صورت هماتوكريت 50 بايد در حد 5/2 سانتي متري خط كش قرار داشته باشد.

مراجع :

الف- كتاب روش هاي كنترل كيفي در خون شناسي – دكتر حبيب اله گل افشان

ب- كتاب تضمين كيفيت در آزمايشگاههاي تشخيص طبي (تأليف : دكتر سيما ذوالفقاري اناركي)

ج-  Quality Assurance in Hematology , WHO, 1998

0 پاسخ به "دستور العمل كنترل كيفيت در آزمايشگاه تشخیص طبی"

ارسال یک پیغام

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد.

درباره

گروه فن آور دی مِیک با سابقه ده ساله در حوزه مدیریت و فن آوری اطلاعات از سال 1397 با تشکیل مجموعه شرکت های دانش بنیان مستقر در پارک علم و فن آوری، فعالیت خود را آغاز کرد. ما بر آنیم تا با ارائه خدمات ویژه به جامعه پزشکی و آزمایشگاهی کشور و بهره گیری از افراد متخصص و خلاق در زمینه های مختلف، خدمات جامع و کاملی را با بهترین کیفیت و بهترین قیمت به مشتریان خود ارئه کنیم .

آکادمی

 

تماس

  • تلفن: (021) 91312424
  • واحد فروش: 09021110087
مرکز انفورماتیک گروه فن آور دی مِیک 2020
X